近年來以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術發(fā)展迅速,其廣泛應用于細胞模型和活體轉基因模型的建立。研究者大多采用靶位點sgRNA聯(lián)合Cas9蛋白顯微注射到動物胚胎實現(xiàn)活體水平目的基因的編輯。為探討能否利用CRISPR/Cas9實現(xiàn)動物體肌肉組織特異的基因編輯,本研究利用Rosa26基因的廣譜性表達,在此基因位置發(fā)生序列變化不影響其他基因功能的特性,將Cas9基因連接到人工合成的肌肉特異表達啟動子(SP啟動子)下游,在C2C12(骨骼肌細胞的前體細胞)中檢測該系統(tǒng)的編輯效率,在此基礎上構建Rosa26位點的同源重組載體,該載體可以整合到C2C12細胞和小鼠胚胎,為肌肉組織特異的基因編輯研究奠定基礎。具體情況如下:1.PX459-Rosa26-SP-DsRed示蹤載體的構建將實驗室前期工作中構建PX459-Rosa26(該載體帶有針對Rosa26位點的sgRNA片段)的CMV啟動子替換為肌肉特異啟動子SP,構建PX459-Rosa26-SP載體。XbaI酶切未切開顯示打靶后C2C12細胞的XbaI位點破壞,T7E1切開顯示發(fā)生切割并NHEJ修復,該載體成功打靶Rosa26基因位點,并...

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 基因編輯技術
        1.1.1 基因編輯技術的發(fā)展
        1.1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)作用原理
        1.1.3 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的比較
        1.1.4 CRISPR/Cas9在細胞和動物模型建立中的應用
    1.2 時空特異性基因編輯
        1.2.1 條件性基因敲除
        1.2.2 組織特異性基因編輯
        1.2.3 肌肉特異性啟動子SP
    1.3 基因敲入位點
        1.3.1 Rosa26位點基因敲入“安全港”
        1.3.2 AAVS腺病毒相關病毒整合位點
    1.4 研究的目的及意義
2 肌肉特異性表達Cas9示蹤載體的構建
    2.1. 實驗材料
        2.1.1 載體信息
        2.1.2 主要試劑和藥品
        2.1.3 實驗儀器及設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 SP啟動子的PCR擴增
        2.2.2 Rosa26-PX459-SP載體構建
        2.2.3 Rosa26-PX459-SP載體酶切
        2.2.4 PX459-Rosa26-SP-DsRed示蹤載體的構建
        2.2.5 Rosa26-PX459-SP在C2C12細胞中編輯活性檢測
        2.2.6 PX459-Rosa26-SP-DsRed示蹤載體的檢測
    2.3 實驗結果
        2.3.1 SP啟動子的擴增
        2.3.2 Rosa26-PX459-SP載體構建
        2.3.3 Rosa26位點Cas9示蹤載體的構建
        2.3.4 PX459-Rosa26-SP表達活性檢驗
    2.4 討論
    2.5 本章小結
3 肌肉特異表達Cas9示蹤同源打靶載體在C2C12細胞中的整合
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗載體信息
        3.1.2 主要試劑及藥品
        3.1.3 主要設備及儀器
        3.1.4 溶液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 同源臂載體Donor的酶切
        3.2.2 SP-Cas9-DsRed的克隆
        3.2.3 Donor-Cas9-SP-DsRed的連接
        3.2.4 細胞的培養(yǎng)與轉染
        3.2.5 PCR鑒定基因敲入情況
    3.3 實驗結果
        3.3.1 同源打靶載體的構建及表達活性檢測
        3.3.2 同源載體在C2C12細胞Rosa26位點的整合
    3.4 討論
    3.5 本章小結
4 肌肉特異表達Cas9示蹤載體在小鼠胚胎中的整合
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物和菌株
        4.1.2 實驗載體信息
        4.1.3 藥品和試劑
        4.1.4 溶液配制
        4.1.5 主要儀器設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 注射用小鼠Rosa26基因sgRNA的制備
        4.2.2 小鼠Rosa26基因sgRNA體外編輯效率檢測
        4.2.3 小鼠胚胎的顯微注射
        4.2.4 小鼠Rosa26基因敲除胚胎編輯效率檢測
        4.2.5 同源打靶載體敲入胚胎編輯效率檢測
        4.2.6 胚胎移植
        4.2.7 出生小鼠基因分型檢測
    4.3 結果
        4.3.1 Rosa26 sgRNA的體外編輯效率
        4.3.2 Rosa26 sgRNA在小鼠胚胎中的編輯效率
        4.3.3 同源重組載體敲入胚胎效率
        4.3.4 胚胎移植后的活體編輯效率
    4.4 討論
    4.5 本章小結
結論
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝



本文編號：3778088