發(fā)布時間：2023-03-19 09:24

　　中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是研究十足目甲殼動物精子發(fā)生的模式物種之一。對中華絨螯蟹精子發(fā)生動力學和信號通路調(diào)控研究,有助于闡明其生殖調(diào)控機制。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是轉化生長因子β(TGFβ)超家族中一個重要的分支,廣泛參與胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞分化等生理活動。本研究主要探究TGFβ超家族中BMP2在中華絨螯蟹精子發(fā)生過程中發(fā)揮的功能及其可能的分子機制。首先從中華絨螯蟹精巢組織中克隆獲得編碼BMP2同源蛋白的基因,中華絨螯蟹es-bmp2基因CDS長1215bp,共編碼404個氨基酸。Es-BMP2包含一段跨膜結構域及TGFβ結構域。與其他物種同源序列比對分析發(fā)現(xiàn),其TGFβ結構域氨基酸序列相對保守。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),其與三疣梭子蟹BMP2蛋白聚為一支。為檢測Es-BMP2蛋白的表達水平和細胞水平定位情況,本研究通過原核表達Es-BMP2融合蛋白及小鼠腹腔注射抗原,制備了Es-BMP2鼠多克隆抗體。隨后利用RT-PCR和Western blot技術探究了Es-BMP2在中華絨螯蟹各組織中的表達模式,并通過免疫熒光實驗觀察了Es-BMP2在精巢中的分布情況...

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
縮略詞及術語表
1 前言
    1.1 精子發(fā)生
        1.1.1 哺乳動物的精子發(fā)生過程
        1.1.2 中華絨螯蟹的精子發(fā)生過程
    1.2 TGFβ超家族信號轉導概述
        1.2.1 性腺發(fā)育和精子發(fā)生中的TGFβ超家族
        1.2.2 BMP2信號通路的相關研究進展
    1.3 甲殼動物中的TGFβ超家族
    1.4 精子發(fā)生中的驅動蛋白
        1.4.1 精子形成中的細胞骨架結構
        1.4.2 Kinesins在細胞分裂和精子形成中的功能
        1.4.3 驅動蛋白14家族KIFC1參與細胞分裂和頂體發(fā)生
2 材料與方法
    2.1 實驗動物
    2.2 實驗試劑
        2.2.1 基因克隆及載體構建相關試劑
        2.2.2 考馬斯亮藍染色、免疫印跡相關試劑及其配制
        2.2.3 抗體制備相關試劑
        2.2.4 蘇木精-伊紅染色相關試劑及其配制
        2.2.5 免疫熒光相關試劑及其配制
        2.2.6 細胞培養(yǎng)及體外干擾相關試劑
    2.3 實驗儀器
    2.4 分子克隆實驗方法
        2.4.1 總RNA提取與反轉錄c DNA
        2.4.2 基因片段克隆
        2.4.3 Rapid amplification of cDNA end(RACE)
        2.4.4 PCR產(chǎn)物驗證
            2.4.4.1 PCR產(chǎn)物純化
            2.4.4.2 T-載體連接及大腸桿菌轉化
            2.4.4.3 挑取單克隆菌落及送測
        2.4.5 生物信息學分析
    2.5 多克隆抗體制備
        2.5.1 原核表達菌株的構建
            2.5.1.1 原核表達載體引物設計
            2.5.1.2 克隆目的片段
            2.5.1.3 質粒抽提
            2.5.1.4 雙酶切反應
            2.5.1.5 獲得含有重組融合表達載體的菌株
        2.5.2 融合蛋白的表達、檢測與純化
            2.5.2.1 融合蛋白的誘導表達
            2.5.2.2 融合蛋白誘導表達檢測(考馬斯亮藍染色)
            2.5.2.3 融合蛋白的純化
        2.5.3 抗原免疫注射
    2.6 免疫印跡
        2.6.1 組織蛋白準備
        2.6.2免疫印跡實驗
    2.7 半定量PCR
    2.8 免疫熒光
        2.8.1 冰凍切片的準備
        2.8.2 組織冰凍切片免疫熒光
    2.9 中華絨螯蟹活體干擾
        2.9.1 dsRNA表達載體構建
        2.9.2 dsRNA的誘導表達
        2.9.3 dsRNA的純化
        2.9.4 中華絨螯蟹活體干擾
        2.9.5 HE染色形態(tài)學觀察
    2.10精巢原代細胞培養(yǎng)及體外干擾實驗
3 實驗結果與分析
    3.1 中華絨螯蟹ES-BMP2基因全長克隆及特征分析
    3.2 ES-BMP2同源蛋白多序列比對及進化樹分析
    3.3 ES-BMP2基因在中華絨螯蟹中的表達特異性
    3.4 ES-BMP2在精子發(fā)生過程不同階段的生殖細胞中的定位
    3.5 ES-BMP2參與調(diào)節(jié)中華絨螯蟹精子形成過程
    3.6 BMP2可能通過調(diào)節(jié)KINESIN-14馬達蛋白KIFC1的表達來維持精子形成
    3.7 ES-KIFC1是ES-BMP2的信號下游分子
4 結論和展望
    4.1 BMP2參與調(diào)節(jié)中華絨螯蟹精子發(fā)生中精核形態(tài)的建成
    4.2 中華絨螯蟹ES-BMP2的調(diào)節(jié)ES-KIFC1表達的分子機制
參考文獻
附錄 I
碩士期間相關研究成果



本文編號：3765000