目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的KNDC1并觀察其抗衰老能力。方法通過在線軟件設(shè)計靶向于KNDC1外顯子1、2、3的5個sgRNAs,并將其構(gòu)建到CRISPR/Cas9載體中;經(jīng)測序確認(rèn)序列正確后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和HUVECs,48 h后用real-time PCR和Western blot分別檢測KNDC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平;用SA-β-gal染色檢測細(xì)胞衰老情況;用2, 7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果測序結(jié)果顯示,設(shè)計的5個sgRNAs全部插入到了CRISPR/Cas9載體中,序列正確,構(gòu)建成功。將5個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)第4和5號載體敲除效率較高,接下來將4和5號重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HUVECs中,發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒相比,轉(zhuǎn)染了4和5號重組質(zhì)粒的HUVECs KNDC1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),衰老HUVECs數(shù)量和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯減少。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)能有效敲除HUVECs的KNDC1,敲除KNDC1的HUV...

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞系:
        1.1.2 載體和試劑:
        1.1.3 引物合成和測序:
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA打靶載體的構(gòu)建:
        1.2.2 在HeLa細(xì)胞中驗證打靶載體的敲除效率:
        1.2.3 在HUVECs中進(jìn)行KNDC1敲除:
        1.2.4 SA-β-gal染色檢測細(xì)胞衰老:
        1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力:
        1.2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的檢測:
    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 用于人 KNDC1敲除的打靶載體的構(gòu)建
    2.2 篩選打靶效率高的重組質(zhì)粒
    2.3 在HUVECs中對KNDC1進(jìn)行敲除驗證
    2.4 敲除KNDC1能夠延緩HUVECs衰老、增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力及降低其活性氧水平
3 討論



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