CRISPR多基因編輯系統(tǒng)在動(dòng)植物中已被廣泛應(yīng)用。為了在乳腺癌細(xì)胞中構(gòu)建一套多基因編輯系統(tǒng),利用內(nèi)源性tRNA自剪切特點(diǎn),將tRNA與小向?qū)NA(sgRNA)進(jìn)行串聯(lián)組合實(shí)現(xiàn)基因編輯,并在MCF7乳腺癌細(xì)胞中對(duì)KLF4、MYC、SOX2和OCT4 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)調(diào)控,在基因水平、蛋白表達(dá)以及功能改變3個(gè)層次驗(yàn)證該多基因編輯系統(tǒng)的功能性與可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示被調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量提高2倍以上,侵襲能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞的存活率提高50%,干細(xì)胞比例由2.57%提高到18.5%。同時(shí),該系統(tǒng)在SUM149PT細(xì)胞系也被驗(yàn)證成功。綜上,一套基于CRISPR的標(biāo)準(zhǔn)、精確、可復(fù)制、高效、可靠的多基因調(diào)控系統(tǒng)首次在乳腺癌細(xì)胞中構(gòu)建成功。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 多基因串聯(lián)質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        1.2.3 實(shí)時(shí)定量qPCR
        1.2.4 Western Blot檢測(cè)
        1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
        1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        1.2.7 干細(xì)胞比例檢測(cè)
2 結(jié)果與分析
    2.1 CRISPR-dCas9多基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建
    2.2 qPCR與Western Blot結(jié)果分析
    2.3 MCF7細(xì)胞在基因編輯后增殖、遷移和干細(xì)胞比例的變化
3 討論與結(jié)論



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