近年來,D-阿洛糖（D-Allose）由于其具防止肥胖、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤以及抗癌癥功能,而受到越來越多的關注。目前,以Izumoring酶法指導生產D-阿洛糖的研究較為廣泛。相比于以D-阿洛酮糖為底物,利用D-果糖為原料,經D-阿洛酮糖3-差向異構酶（D-psicose 3-epimerase,DPE）和L-鼠李糖異構酶（L-rhamnose isomerase,LRI）作用生產高附加值D-阿洛糖,將成為更加認可的生產路線。釀酒酵母一直被美國FDA（Food and Drug Administration）認為是GRAS（Generally Recognized As Safe）生產菌株,具備安全無致病性、遺傳背景清晰、培養(yǎng)簡單和繁殖迅速等優(yōu)勢,因此以釀酒酵母為宿主生產D-阿洛糖在確保食品安全性等方面具有相當大的優(yōu)勢。由于釀酒酵母體內的己糖激酶同工酶2（Hexokinase isoenzyme 2,HXK2）可以將果糖磷酸化果糖-6-磷酸,因此有必要將其缺陷而構建果糖低消耗宿主菌株,從而提高D-阿洛糖的產量。具體研究方法和結果如下:（1）釀酒酵母中高效CRISPR/Cas9基因... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 功能性稀有糖
        1.1.1 稀有糖概述
        1.1.2 Izumoring策略
        1.1.3 非Izumoring策略
    1.2 D-阿洛糖的概述
        1.2.1 D-阿洛糖物理化學特性
        1.2.2 D-阿洛糖的生理學功能
        1.2.3 D-阿洛糖的生物合成
    1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的概述
        1.3.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現
        1.3.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類及作用機制
        1.3.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在釀酒酵母中的應用
    1.4 論文的研究意義以及主要研究內容
        1.4.1 課題研究意義
        1.4.2 主要研究內容
        1.4.3 研究技術路線
第二章 釀酒酵母中高效CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的構建
    2.1 引言
    2.2 材料與設備
        2.2.1 菌株和質粒
        2.2.2 主要儀器和設備
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 培養(yǎng)基與溶液
    2.3 實驗方法
        2.3.1 rDNA整合型Cas9 表達質粒的構建
        2.3.2 rDNA整合型Cas9 表達菌株的構建
        2.3.3 靶向ade2 位點的gRNA表達質粒的構建
        2.3.4 靶向ade2 位點的Cas9/gRNA共表達游離型質粒的構建
        2.3.5 ade2 位點雙鏈斷裂修復donorDNA構建
        2.3.6 釀酒酵母ade2缺失菌株的構建
    2.4 結果討論
        2.4.1 釀酒酵母rDNA整合型Cas9 表達菌株的構建
        2.4.2 donor-tll2 表達盒的構建
        2.4.3 rDNA整合型Cas9 介導的釀酒酵母ade2 基因缺失菌的構建
        2.4.4 游離型Cas9 系統(tǒng)介導的釀酒酵母ade2 基因缺失菌的構建
        2.4.5 不同敲除系統(tǒng)對ade2基因編輯效率的影響
    2.5 本章小結
第三章 基于CRISPR/Cas9 構建釀酒酵母果糖低消耗宿主菌
    3.1 引言
    3.2 材料與設備
        3.2.1 菌株和質粒
        3.2.2 儀器和設備
        3.2.3 試劑
        3.2.4 培養(yǎng)基與溶液
    3.3 實驗方法
        3.3.1 p YES2-CG-?hxk2 敲除質粒的構建
        3.3.2 donor-hxk2 的構建
        3.3.3 釀酒酵母hxk2基因敲除菌的構建
        3.3.4 菌株BY4741-?hxk2的果糖發(fā)酵培養(yǎng)
        3.3.5 果糖含量的測定
        3.3.6 數據處理
    3.4 結果討論
        3.4.1 敲除質粒p YES2-CG-?hxk2 的構建
        3.4.2 donor-hxk2 的構建
        3.4.3 釀酒酵母hxk2基因敲除菌的構建
        3.4.4 菌株BY4741-?hxk2的生長特性
        3.4.5 菌株BY4741-?hxk2對果糖利用
    3.5 本章小結
第四章 D-阿洛糖的生物合成
    4.1 引言
    4.2 材料與設備
        4.2.1 菌株和質粒
        4.2.2 主要儀器和設備
        4.2.3 主要試劑
        4.2.4 培養(yǎng)基與溶液
    4.3 實驗方法
        4.3.1 D-阿洛酮糖/D-阿洛糖為唯一碳源培養(yǎng)釀酒酵母
        4.3.2 dep和 lri基因串聯表達盒的構建
        4.3.3 D-阿洛糖生產菌株的構建
        4.3.4 改造菌株Y1的搖瓶發(fā)酵
        4.3.5 糖的測定
    4.4 結果討論
        4.4.1 釀酒酵母對D-阿洛酮糖的利用
        4.4.2 釀酒酵母對D-阿洛糖的利用
        4.4.3 dep和 lri基因串聯表達盒的構建
        4.4.4 D-阿洛糖生產菌株的構建
        4.4.5 釀酒酵母菌株Y1的搖瓶發(fā)酵
    4.5 本章小結
結論與展望
    結論
    展望
    本論文創(chuàng)新點
參考文獻
攻讀碩士學位期間取得的研究成果
致謝
附件


【參考文獻】：
期刊論文
[1]D-阿洛酮糖的功能及其生物合成研究進展[J]. 沈雪梅,王靖,張媛,王小艷,丁子元,李義,陳博,佟毅.  生物工程學報. 2018(09)
[2]CRISPR/Cas9介導的高產谷胱甘肽原養(yǎng)型酵母工程菌的構建[J]. 周文龍,唐亮,成凱,劉忞之,楊燕,王偉.  生物工程學報. 2017(12)
[3]釀酒酵母rDNA的結構及其介導整合影響因素研究進展[J]. 孫恒一,臧曉南,張學成.  武漢大學學報(理學版). 2014(01)
[4]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)
[5]CRISPR-Cas系統(tǒng)與細菌和噬菌體的共進化[J]. 李鐵民,杜波.  遺傳. 2011(03)

博士論文
[1]D-阿洛酮糖3-差向異構酶的高效表達、酶學性質及分子改造[D]. 張文立.江南大學 2017

碩士論文
[1]馬克斯克魯維酵母D-阿洛酮糖-3-差向異構酶基因工程菌的構建[D]. 朱星星.合肥工業(yè)大學 2018
[2]釀酒酵母孢子固定化酶催化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的研究[D]. 李毅.江南大學 2015



本文編號：3720103