【背景】在模塊化聚酮合成酶（polyketidesynthase,PKS）的催化過(guò)程中,催化結(jié)構(gòu)域與同源�；d體蛋白（acyl-carrierprotein,ACP）之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用起重要作用,但這種瞬時(shí)可逆的相互作用難以捕捉分析�！灸康摹揩@得ACP和酮基還原酶（ketoreductase,KR）相互作用的蛋白復(fù)合物�！痉椒ā吭贙R和ACP之間的Linker上插入煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus,TEV）蛋白酶切位點(diǎn),通過(guò)雙功能馬來(lái)酰亞胺試劑BMH將KR和ACP共價(jià)交聯(lián),隨后TEV酶切檢測(cè)交聯(lián)結(jié)果。調(diào)整反應(yīng)條件,使交聯(lián)效率最大化。根據(jù)KR-ACP交聯(lián)復(fù)合物與體系內(nèi)其他蛋白標(biāo)簽和分子量的差異,通過(guò)親和層析和凝膠過(guò)濾等純化手段,獲得純度較高的KR-ACP穩(wěn)定交聯(lián)復(fù)合物�！窘Y(jié)果】單獨(dú)表達(dá)的KR和ACP結(jié)構(gòu)域交聯(lián)不成功,融合表達(dá)的KR+ACP雙結(jié)構(gòu)域可以有效交聯(lián),結(jié)合使用親和層析和凝膠過(guò)濾等純化手段成功獲得純度較高的復(fù)合物。該策略可運(yùn)用于多個(gè)KR和ACP的共價(jià)交聯(lián)�！窘Y(jié)論】建立了捕獲并純化KR和ACP瞬時(shí)相互作用復(fù)合物的有效方法,為后期晶體結(jié)構(gòu)的解析、KR與ACP... 

【文章頁(yè)數(shù)】：12 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物
        1.1.2 主要試劑和儀器
    1.2 方法
        1.2.1 AmpKR2與同源ACP單結(jié)構(gòu)域交聯(lián)
        1.2.2 雙結(jié)構(gòu)域交聯(lián)
        1.2.3 Amp KR-ACP2交聯(lián)復(fù)合物純化
2 結(jié)果與分析
    2.1 AmpKR2與同源ACP單結(jié)構(gòu)域交聯(lián)結(jié)果
    2.2 雙結(jié)構(gòu)域交聯(lián)結(jié)果
    2.3 Amp KR-ACP2交聯(lián)復(fù)合物純化
3 討論與結(jié)論



本文編號(hào)：3703300