流感病毒（influenza virus）對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅,每年造成近十億人感染及數(shù)十萬(wàn)人死亡。流感病毒基因組的高突變率和基因重配導(dǎo)致新毒株不斷產(chǎn)生,從而逃避機(jī)體已有的適應(yīng)性免疫,造成現(xiàn)有防控措施部分失效。流感病毒主要侵犯機(jī)體呼吸系統(tǒng),重則發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征,導(dǎo)致患者死亡。機(jī)體天然免疫反應(yīng)在對(duì)抗流感病毒中起重要作用,但過(guò)度免疫反應(yīng)造成的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是導(dǎo)致急性肺損傷的重要原因。因此,進(jìn)一步深入研究流感病毒的免疫機(jī)制對(duì)更有效地防控流感病毒至關(guān)重要。目前對(duì)流感病毒免疫機(jī)制的研究多集中在蛋白分子上,而對(duì)RNA分子在其中所起作用研究較少。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新的非編碼RNA,在發(fā)育分化、癌癥、心血管疾病、免疫反應(yīng)等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。盡管已有報(bào)道少數(shù)lnc RNA參與機(jī)體抗病毒免疫,但仍存在大量功能未知的lnc RNA,在流感病毒免疫反應(yīng)中的作用有待進(jìn)一步研究。因此,探索lnc RNA在抗流感病毒中的作用及機(jī)制,將有助于進(jìn)一步理解機(jī)體對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)機(jī)制,為開(kāi)發(fā)新型抗流感病毒方法及藥物提供理論依據(jù)。基... 

【文章頁(yè)數(shù)】：113 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一章 IVRPIE在 IAV感染后的表達(dá)情況及對(duì)IAV增殖的作用
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.1 細(xì)胞系
        1.1.2 病毒
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.1.4 表達(dá)載體及克隆載體
        1.1.5 主要試劑
        1.1.6 主要儀器和設(shè)備
        1.1.7 生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)分析軟件
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 病毒感染細(xì)胞及樣品收集
        1.2.2 poly I:C轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        1.2.3 IFN-β刺激細(xì)胞
        1.2.4 信號(hào)通路抑制劑處理細(xì)胞
        1.2.5 RT-q PCR檢測(cè)lnc RNA表達(dá)
        1.2.6 質(zhì)粒構(gòu)建
        1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染接毒實(shí)驗(yàn)
        1.2.8 HA試驗(yàn)測(cè)定IAV效價(jià)
        1.2.9 對(duì)IVRPIE蛋白編碼能力進(jìn)行預(yù)測(cè)
        1.2.10 Rapid amplification of c DNA ends(RACE)
        1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.3.1 IVRPIE在 IAV感染后表達(dá)升高
        1.3.2 IVRPIE抑制IAV復(fù)制
        1.3.3 IVRPIE在 IAV感染后表達(dá)具有時(shí)間依賴性及劑量依賴性
        1.3.4 IVRPIE在多種病毒感染后表達(dá)升高
        1.3.5 IVRPIE在 poly I:C刺激后升高
        1.3.6 IVRPIE主要在肺上皮細(xì)胞表達(dá)
        1.3.7 IVRPIE基本性質(zhì)
        1.3.8 IVRPIE表達(dá)調(diào)控機(jī)制探究
    1.4 討論
    1.5 小結(jié)
第二章 IVRPIE通過(guò)促進(jìn)IFNβ1 及幾個(gè)重要ISG的表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞系
        2.1.2 病毒
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.4 重組質(zhì)粒及反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)
        2.1.5 主要試劑
        2.1.6 主要儀器和設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染接毒實(shí)驗(yàn)
        2.2.2 HA試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度
        2.2.3 空斑形成試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度
        2.2.4 組織半數(shù)致死量(median tissue culture infective dose,TCID50)試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度
        2.2.5 RT-q PCR檢測(cè)IFNβ1及ISG表達(dá)
        2.2.6 Western blotting
        2.2.7 ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞因子含量
        2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 HA試驗(yàn)表明IVRPIE抑制IAV復(fù)制
        2.3.2 空斑形成試驗(yàn)表明IVRPIE抑制IAV復(fù)制
        2.3.3 Western blotting實(shí)驗(yàn)表明IVRPIE抑制IAV復(fù)制
        2.3.4 TCID50 實(shí)驗(yàn)證明IVRPIE抑制VSV復(fù)制
        2.3.5 IVRPIE不通過(guò)調(diào)控TANK基因表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用
        2.3.6 IVRPIE不通過(guò)調(diào)控RIG-I信號(hào)通路抗病毒作用
        2.3.7 IVRPIE通過(guò)調(diào)控IFNβ1 及幾個(gè)關(guān)鍵ISG的表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 IVRPIE通過(guò)與hn RNP U相互作用改變組蛋白修飾調(diào)控IFNβ1及ISG的表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞系
        3.1.2 病毒
        3.1.3 重組質(zhì)粒及ASO
        3.1.4 主要試劑
        3.1.5 主要儀器和設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染接毒實(shí)驗(yàn)
        3.2.2 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)
        3.2.3 染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR實(shí)驗(yàn)(Chromatinimmunoprecipitation-quantitative PCR,Ch IP-q PCR)
        3.2.4 RNA pull-down實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)
        3.2.6 hn RNP U敲降實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 IVRPIE主要分布于細(xì)胞核中
        3.3.2 IVRPIE通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象調(diào)控IFNβ1及ISG表達(dá)
        3.3.3 hnRNP U是與IVRPIE相互作用的蛋白分子
        3.3.4 敲降hn RNP U導(dǎo)致IFNβ1及ISG表達(dá)顯著降低
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 IVRPIE在小鼠體內(nèi)具有抑制病毒復(fù)制的作用
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 細(xì)胞系
        4.1.2 病毒
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.4 表達(dá)載體及克隆載體
        4.1.5 主要試劑
        4.1.6 主要儀器和設(shè)備
        4.1.7 生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)分析軟件
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 p VAX1-IVRPIE構(gòu)建
        4.2.2 小鼠感染實(shí)驗(yàn)
        4.2.3 小鼠肺組織中IVRPIE表達(dá)量檢測(cè)
        4.2.4 小鼠肺臟病毒滴度檢測(cè)
        4.2.5 小鼠肺組織濕干比檢測(cè)
        4.2.6 小鼠肺臟病理檢測(cè)
        4.2.7 小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)收集及細(xì)胞因子檢測(cè)
        4.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 IVRPIE在小鼠肺部表達(dá)
        4.3.2 IVRPIE過(guò)表達(dá)能降低小鼠感染IAV后死亡率
        4.3.3 IVRPIE過(guò)表達(dá)降低小鼠感染IAV后肺組織病毒滴度
        4.3.4 IVRPIE過(guò)表達(dá)能減輕小鼠感染IAV后肺損傷
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
作者在學(xué)期間取得的學(xué)術(shù)成果
主要簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3699934