流感病毒（influenza virus）對人類健康構成嚴重威脅,每年造成近十億人感染及數(shù)十萬人死亡。流感病毒基因組的高突變率和基因重配導致新毒株不斷產生,從而逃避機體已有的適應性免疫,造成現(xiàn)有防控措施部分失效。流感病毒主要侵犯機體呼吸系統(tǒng),重則發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征,導致患者死亡。機體天然免疫反應在對抗流感病毒中起重要作用,但過度免疫反應造成的“細胞因子風暴”是導致急性肺損傷的重要原因。因此,進一步深入研究流感病毒的免疫機制對更有效地防控流感病毒至關重要。目前對流感病毒免疫機制的研究多集中在蛋白分子上,而對RNA分子在其中所起作用研究較少。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的非編碼RNA,在發(fā)育分化、癌癥、心血管疾病、免疫反應等生命活動中發(fā)揮重要作用。盡管已有報道少數(shù)lnc RNA參與機體抗病毒免疫,但仍存在大量功能未知的lnc RNA,在流感病毒免疫反應中的作用有待進一步研究。因此,探索lnc RNA在抗流感病毒中的作用及機制,將有助于進一步理解機體對流感病毒的免疫反應機制,為開發(fā)新型抗流感病毒方法及藥物提供理論依據(jù)�；�... 

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一章 IVRPIE在 IAV感染后的表達情況及對IAV增殖的作用
    1.1 實驗材料
        1.1.1 細胞系
        1.1.2 病毒
        1.1.3 實驗動物
        1.1.4 表達載體及克隆載體
        1.1.5 主要試劑
        1.1.6 主要儀器和設備
        1.1.7 生物信息學及統(tǒng)計分析軟件
    1.2 實驗方法
        1.2.1 病毒感染細胞及樣品收集
        1.2.2 poly I:C轉染細胞
        1.2.3 IFN-β刺激細胞
        1.2.4 信號通路抑制劑處理細胞
        1.2.5 RT-q PCR檢測lnc RNA表達
        1.2.6 質粒構建
        1.2.7 細胞轉染接毒實驗
        1.2.8 HA試驗測定IAV效價
        1.2.9 對IVRPIE蛋白編碼能力進行預測
        1.2.10 Rapid amplification of c DNA ends(RACE)
        1.2.11 統(tǒng)計學分析
    1.3 實驗結果
        1.3.1 IVRPIE在 IAV感染后表達升高
        1.3.2 IVRPIE抑制IAV復制
        1.3.3 IVRPIE在 IAV感染后表達具有時間依賴性及劑量依賴性
        1.3.4 IVRPIE在多種病毒感染后表達升高
        1.3.5 IVRPIE在 poly I:C刺激后升高
        1.3.6 IVRPIE主要在肺上皮細胞表達
        1.3.7 IVRPIE基本性質
        1.3.8 IVRPIE表達調控機制探究
    1.4 討論
    1.5 小結
第二章 IVRPIE通過促進IFNβ1 及幾個重要ISG的表達發(fā)揮抗病毒作用
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞系
        2.1.2 病毒
        2.1.3 實驗動物
        2.1.4 重組質粒及反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)
        2.1.5 主要試劑
        2.1.6 主要儀器和設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞轉染接毒實驗
        2.2.2 HA試驗測定病毒滴度
        2.2.3 空斑形成試驗測定病毒滴度
        2.2.4 組織半數(shù)致死量(median tissue culture infective dose,TCID50)試驗測定病毒滴度
        2.2.5 RT-q PCR檢測IFNβ1及ISG表達
        2.2.6 Western blotting
        2.2.7 ELISA實驗測定細胞因子含量
        2.2.8 統(tǒng)計學分析
    2.3 實驗結果
        2.3.1 HA試驗表明IVRPIE抑制IAV復制
        2.3.2 空斑形成試驗表明IVRPIE抑制IAV復制
        2.3.3 Western blotting實驗表明IVRPIE抑制IAV復制
        2.3.4 TCID50 實驗證明IVRPIE抑制VSV復制
        2.3.5 IVRPIE不通過調控TANK基因表達發(fā)揮抗病毒作用
        2.3.6 IVRPIE不通過調控RIG-I信號通路抗病毒作用
        2.3.7 IVRPIE通過調控IFNβ1 及幾個關鍵ISG的表達發(fā)揮抗病毒作用
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 IVRPIE通過與hn RNP U相互作用改變組蛋白修飾調控IFNβ1及ISG的表達
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞系
        3.1.2 病毒
        3.1.3 重組質粒及ASO
        3.1.4 主要試劑
        3.1.5 主要儀器和設備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞轉染接毒實驗
        3.2.2 核質分離實驗
        3.2.3 染色質免疫沉淀-定量PCR實驗(Chromatinimmunoprecipitation-quantitative PCR,Ch IP-q PCR)
        3.2.4 RNA pull-down實驗
        3.2.5 RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)
        3.2.6 hn RNP U敲降實驗
        3.2.7 統(tǒng)計學分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 IVRPIE主要分布于細胞核中
        3.3.2 IVRPIE通過改變染色質構象調控IFNβ1及ISG表達
        3.3.3 hnRNP U是與IVRPIE相互作用的蛋白分子
        3.3.4 敲降hn RNP U導致IFNβ1及ISG表達顯著降低
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 IVRPIE在小鼠體內具有抑制病毒復制的作用
    4.1 實驗材料
        4.1.1 細胞系
        4.1.2 病毒
        4.1.3 實驗動物
        4.1.4 表達載體及克隆載體
        4.1.5 主要試劑
        4.1.6 主要儀器和設備
        4.1.7 生物信息學及統(tǒng)計分析軟件
    4.2 實驗方法
        4.2.1 p VAX1-IVRPIE構建
        4.2.2 小鼠感染實驗
        4.2.3 小鼠肺組織中IVRPIE表達量檢測
        4.2.4 小鼠肺臟病毒滴度檢測
        4.2.5 小鼠肺組織濕干比檢測
        4.2.6 小鼠肺臟病理檢測
        4.2.7 小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)收集及細胞因子檢測
        4.2.8 統(tǒng)計學分析
    4.3 實驗結果
        4.3.1 IVRPIE在小鼠肺部表達
        4.3.2 IVRPIE過表達能降低小鼠感染IAV后死亡率
        4.3.3 IVRPIE過表達降低小鼠感染IAV后肺組織病毒滴度
        4.3.4 IVRPIE過表達能減輕小鼠感染IAV后肺損傷
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 結論與展望
參考文獻
作者在學期間取得的學術成果
主要簡歷
致謝



本文編號：3699934