乳二糖（lacto-N-biose,LNB）是母乳寡糖中的重要組成部分,也是雙歧桿菌維持生命活動的重要底物,它在促進嬰幼兒腸道中雙歧桿菌的定植和增殖中起重要作用。雙歧桿菌可以通過乳二糖磷酸化酶（lacto-N-biose phosphorylase,LNBP）來代謝LNB獲得生命活性所需要的能量。LNBP（EC2.4.1.211）是一種可逆的磷酸化酶,可以催化LNB和GNB（galacto-N-biose）產(chǎn)生N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）,N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和β-D-半乳糖-1-磷酸（Gal 1-P）。Wada等證實雙歧桿菌中具有編碼代謝LNB的基因簇,其中LNB通過特定的ABC型轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì),它由LNBP最終在糖酵解和氨基糖代謝途徑中代謝。從長雙歧桿菌JCM 1217（Bifidobacterium longum JCM1217）克隆乳二糖磷酸化酶基因,將該基因與載體pET28a連接構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET28a-LNBP,將pET28a-LNBP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中構(gòu)建了重組工程菌株E.coli BL21/pET28a... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 乳二糖磷酸化酶
        1.1.1 乳二糖磷酸化酶概述
        1.1.2 乳二糖磷酸化酶的應用
        1.1.3 乳二糖磷酸化酶的研究進展
    1.2 蛋白表達系統(tǒng)
        1.2.1 原核表達系統(tǒng)
        1.2.2 真核表達系統(tǒng)
    1.3 本論文研究的主要內(nèi)容及意義
        1.3.1 研究目的及意義
        1.3.2 研究內(nèi)容
第二章 LNBP在大腸桿菌中的表達
    2.1 實驗材料與設備
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        2.1.3 主要試劑及試劑的配制
        2.1.4 主要儀器與設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.2 重組菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的驗證
        2.2.3 重組菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的表達
        2.2.4 粗酶液的制備
        2.2.5 SDS-PAGE電泳檢測
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 重組菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的構(gòu)建
        2.3.2 重組LNBP在大腸桿菌BL21 中的表達
    2.4 本章小結(jié)
第三章 LNBP在大腸桿菌中的表達條件優(yōu)化
    3.1 實驗材料與設備
        3.1.1 菌株
        3.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 主要儀器與設備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 誘導條件的優(yōu)化
        3.2.2 顯著性分析
        3.2.3 LNBP酶活性的測定
        3.2.4 蛋白含量的測定及SDS-PAGE分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 Gal1-P濃度的標準曲線
        3.3.2 初始菌密度對重組LNBP表達的影響
        3.3.3 IPTG濃度對重組LNBP表達的影響
        3.3.4 誘導溫度對重組LNBP表達的影響
        3.3.5 誘導時間對重組LNBP表達的影響
        3.3.6 振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速對重組LNBP表達的影響
        3.3.7 正交試驗
    3.4 本章小結(jié)
第四章 LNBP工程菌的構(gòu)建及在枯草芽孢桿菌中的表達優(yōu)化
    4.1 實驗材料與設備
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要試劑及配置
        4.1.3 主要儀器與設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 LNBP基因的克隆
        4.2.2 枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化
        4.2.3 重組菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP的驗證
        4.2.4 LNBP的表達和純化
        4.2.5 誘導條件的優(yōu)化
        4.2.6 LNBP酶活性的測定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 Gal1-P濃度的標準曲線
        4.3.2 LNBP的擴增
        4.3.3 雙重消化表達載體和PCR產(chǎn)物
        4.3.4 重組菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP在平板上的生長情況
        4.3.5 重組LNBP在枯草芽孢桿菌中的表達
        4.3.6 誘導時間對重組LNBP表達的影響
        4.3.7 誘導溫度對重組LNBP表達的影響
        4.3.8 振蕩速度對重組LNBP表達的影響
        4.3.9 初始細胞密度對重組LNBP表達的影響
        4.3.10 IPTG濃度對重組LNBP表達的影響
    4.4 本章小結(jié)
第五章 LNBP的純化及部分酶學性質(zhì)分析
    5.1 實驗材料與設備
        5.1.1 實驗材料
        5.1.2 主要試劑及試劑的配制
        5.1.3 主要儀器與設備
    5.2 實驗方法
        5.2.1 重組LNBP的純化
        5.2.2 重組LNBP的部分酶學性質(zhì)分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 重組LNBP的純化
        5.3.2 重組LNBP的最適反應溫度
        5.3.3 重組LNBP的最適pH
    5.4 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表文章
攻讀碩士期間申請國家發(fā)明專利


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3691381