氧化脅迫產生的活性氧自由基能造成蛋白質、脂質及DNA等生物大分子的氧化損傷。氧保護系統(tǒng)（如過氧化氫酶KatE）在清除活性氧自由基,保護細胞免受氧化損傷的過程中發(fā)揮重要作用,但其表達調控機制尚不清楚。研究表明細菌非編碼RNA（ncRNAs）廣泛參與各種逆境脅迫反應,但在具有超強氧化脅迫抗性的耐輻射異常球菌中,其ncRNAs是否參與氧保護系統(tǒng)介導的氧化脅迫反應調控報道甚少。本研究從耐輻射異常球菌中鑒定了一個特異響應氧化脅迫信號的ncRNA,將其命名為OsiR（Oxidative stress induced regulatory RNA）。圍繞OsiR的功能及其在氧化脅迫反應中的作用機制開展研究,取得的主要研究結果如下:1.序列比對分析表明,OsiR是一個Deinococcus屬特有的非編碼RNA。5’RACE實驗結果表明,osiR在I號染色體上反向轉錄,轉錄起始于第1,029,200位的腺嘌呤（A）。Northern blot和qRT-PCR結果表明,osiR在氧化脅迫（H₂O₂）條件下顯著誘導表達。啟動子調控元件預測和qRT-PCR結果表明,... 

【文章頁數】：133 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 細菌非編碼RNA研究進展
        1.1.1 細菌ncRNAs的發(fā)現(xiàn)及鑒定
        1.1.2 細菌ncRNAs的分類
        1.1.3 細菌ncRNAs調控作用的分子機制
        1.1.4 細菌ncRNAs的調控特性
        1.1.5 細菌ncRNAs參與的代謝調控
        1.1.6 ncRNA/mRNA互作的結果
        1.1.7 分子伴侶蛋白Hfq在 ncRNAs調控機制中的作用
    1.2 耐輻射異常球菌ncRNAs的研究現(xiàn)狀
    1.3 耐輻射異常球菌的氧化脅迫抗性機制研究進展
        1.3.1 耐輻射異常球菌的抗氧化系統(tǒng)
        1.3.2 耐輻射異常球菌中抗氧化系統(tǒng)的調節(jié)因子
    1.4 立題依據和研究意義
    1.5 技術路線
第二章 耐輻射異常球菌ncRNA OsiR的序列特征與表達分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 酶、試劑盒和化學試劑
        2.1.4 Northern blot試劑配制
        2.1.5 主要儀器
        2.1.6 主要的生物軟件
        2.1.7 本章節(jié)所使用的引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株培養(yǎng)條件
        2.2.2 耐輻射異常球菌總RNA的提取方法
        2.2.3 RNA反轉錄及實時熒光定量PCR
        2.2.4 Northern blot
        2.2.5 5'RACE
    2.3 結果分析
        2.3.1 osiR在基因組中的位置及進化分析
        2.3.2 OsiR的結構特征
        2.3.3 osiR轉錄起始位點的確定
        2.3.4 osiR在各種逆境脅迫下的表達
        2.3.5 osiR的轉錄調控
    2.4 討論
第三章 OsiR的功能鑒定
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 酶、化學試劑、試劑盒與儀器
    3.2 方法
        3.2.1 引物設計及融合PCR反應
        3.2.2 酶切反應、連接及轉化實驗
        3.2.3 細菌質粒的提取
        3.2.4 耐輻射異常球菌基因組DNA的提取
        3.2.5 過氧化氫沖擊實驗
        3.2.6 過氧化氫酶活測定
        3.2.7 細菌總抗氧化能力測定
        3.2.8 耐輻射異常球菌感受態(tài)細胞的制備及DNA轉化方法
        3.2.9 耐輻射異常球菌生長曲線的測定
    3.3 結果與分析
        3.3.1 osiR缺失突變株、回補株和過表達菌株的構建及驗證
        3.3.2 不同菌株生長曲線的測定
        3.3.3 osiR的缺失對菌株氧化脅迫抗性的影響
        3.3.4 osiR的缺失對菌株總抗氧化能力和過氧化氫酶活的影響
        3.3.5 osiR的缺失對抗氧化酶基因表達的影響
    3.4 討論
第四章 OsiR與靶標基因katE2 的互作機制研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 培養(yǎng)基
        4.1.3 酶、化學試劑、試劑盒與儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 mRNA半衰期測定實驗
        4.2.2 微量熱泳動實驗
    4.3 結果與分析
        4.3.1 OsiR與 katE2 mRNA互作位點的分析
        4.3.2 osiR的缺失和過表達對katE2 表達量的影響
        4.3.3 osiR的缺失對katE2 mRNA半衰期和Kat E2 蛋白表達水平的影響
        4.3.4 katE2的缺失對菌株氧化脅迫抗性的影響
        4.3.5 OsiR與 katE2 mRNA互作位點的突變對菌株氧化脅迫抗性的影響
    4.4 討論
第五章 OsiR與靶標基因trmE的互作機制研究
    5.1 實驗材料
    5.2 實驗方法
    5.3 結果與分析
        5.3.1 耐輻射異常球菌trmE基因的生物信息學分析
        5.3.2 MST驗證OsiR與trmE mRNA的互作
        5.3.3 osiR的缺失對trmE表達的影響
        5.3.4 trmE突變株、回補株和過表達株的構建及驗證
        5.3.5 trmE的缺失對菌株氧化脅迫抗性的影響
    5.4 討論
第六章 氧化脅迫條件下耐輻射異常球菌轉錄組和蛋白組分析
    6.1 實驗材料
    6.2 實驗方法
        6.2.1 氧化脅迫處理方法
        6.2.2 細菌總RNA提取方法
        6.2.3 RNA-Seq測序流程
        6.2.4 RNA-Seq數據分析流程
        6.2.5 細菌蛋白質的提取和消化
        6.2.6 LC-MS/MS分析及數據采集
        6.2.7 蛋白組GO和 KEGG富集分析
        6.2.8 蛋白-蛋白互作預測
    6.3 結果與分析
        6.3.1 RNA-Seq測序數據的概況
        6.3.2 差異表達基因的總體分析
        6.3.3 正常生長和氧化脅迫條件下差異表達基因的GO和 KEGG分析
        6.3.4 野生型菌株和突變株ΔosiR中差異表達基因的GO和 KEGG分析
        6.3.5 不同時間氧化脅迫對耐輻射異常球菌基因表達的影響
        6.3.6 氧化脅迫條件下OsiR對耐輻射異常球菌基因表達的影響
        6.3.7 正常生長和氧化脅迫條件下的差異表達蛋白
        6.3.8 差異表達蛋白的GO、KEGG和 COG分析
        6.3.9 差異表達蛋白的PPI網絡分析
        6.3.10 氧化脅迫對耐輻射異常球菌蛋白表達的影響
    6.4 討論
第七章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3671582