間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是細(xì)胞治療和組織工程產(chǎn)品重要的種子細(xì)胞之一,由于從機(jī)體組織中獲取的MSCs數(shù)量有限,故需要進(jìn)行體外擴(kuò)增。MSCs體外擴(kuò)增受多種因素影響,如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)過程中的操作參數(shù)等。采用傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基擴(kuò)增MSCs,無法滿足臨床應(yīng)用的要求;而現(xiàn)有的化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基（Serum free medium,SFM）支持MSCs增殖的能力有限。針對上述問題,本文以人臍帶來源的MSCs為研究對象,考察在無血清培養(yǎng)條件下胰酶濃度及消化時間對細(xì)胞收獲及繼代培養(yǎng)的影響,探究培養(yǎng)基關(guān)鍵組分肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor,HGF）對MSCs體外增殖的作用及潛在機(jī)制,以改善自制成分明確的SFM的促細(xì)胞增殖能力。研究結(jié)果表明,與含血清培養(yǎng)基相比,在商業(yè)化SFM和自制的SFM中MSCs的增殖和連續(xù)傳代能力較弱;低濃度、短時間的胰酶消化處理不利于細(xì)胞收獲;而高濃度、長時間的胰酶消化處理破壞細(xì)胞表面整合素β1,導(dǎo)致細(xì)胞周期的延滯,從而對MSCs繼代培養(yǎng)時的黏附和增殖產(chǎn)生不良影響,因此選擇0.25%胰酶消化3 ... 

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
附錄
第1章 前言
    1.1 再生醫(yī)學(xué)與干細(xì)胞
        1.1.1 再生醫(yī)學(xué)與干細(xì)胞
        1.1.2 干細(xì)胞分類與應(yīng)用
    1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的特性
        1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來源
            1.2.1.1 骨髓
            1.2.1.2 脂肪
            1.2.1.3 臍帶
        1.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用
    1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增
        1.3.1 細(xì)胞分離
        1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.3.2.1 培養(yǎng)方式
            1.3.2.2 培養(yǎng)基
        1.3.3 細(xì)胞收獲
    1.4 培養(yǎng)基關(guān)鍵組分對MSCs生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)
        1.4.1 無血清培養(yǎng)基的組分
            1.4.1.1 糖類
            1.4.1.2 氨基酸
            1.4.1.3 脂質(zhì)
            1.4.1.4 維生素
            1.4.1.5 無機(jī)鹽
            1.4.1.6 細(xì)胞因子
        1.4.2 調(diào)節(jié)MSCs增殖的信號途徑
            1.4.2.1 MAPK途徑
            1.4.2.2 PI3K途徑
            1.4.2.3 NF-κB途徑
            1.4.2.4 JAK/STAT途徑
        1.4.3 無血清培養(yǎng)基的研究現(xiàn)狀及存在問題
    1.5 課題提出
第2章 培養(yǎng)基和胰酶消化對MSCs增殖的影響
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 生長培養(yǎng)基的配制
        2.2.2 MSCs的培養(yǎng)
        2.2.3 MSCs的傳代
        2.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.2.5 細(xì)胞貼壁檢測
        2.2.6 細(xì)胞增殖檢測
        2.2.7 生長曲線測定
        2.2.8 細(xì)胞存活率檢測
        2.2.9 細(xì)胞周期檢測
        2.2.10 Western blot檢測
        2.2.11 細(xì)胞表面表型檢測
        2.2.12 成骨誘導(dǎo)分化
        2.2.13 成脂誘導(dǎo)分化
        2.2.14 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 含血清培養(yǎng)基中MSCs的生長和分化
            2.3.1.1 MSCs的形態(tài)與增殖
            3.3.1.2 MSCs的傳代培養(yǎng)
            2.3.1.3 MSCs的表面表型
            2.3.1.4 MSCs誘導(dǎo)分化
        2.3.2 無血清培養(yǎng)條件下MSCs的生長和傳代
            2.3.2.1 MSCs的貼壁
            2.3.2.2 MSCs的增殖
            2.3.2.3 MSCs的連續(xù)傳代
        2.3.3 胰酶濃度和消化時間對MSCs繼代培養(yǎng)的影響
            2.3.3.1 胰酶濃度和消化時間對MSCs細(xì)胞收獲的影響
            2.3.3.2 胰酶濃度和消化時間對MSCs貼壁的影響
            2.3.3.3 胰酶濃度和消化時間對MSCs增殖的影響
            2.3.3.4 胰酶濃度和消化時間對MSCs整合素表達(dá)的影響
            2.3.3.5 胰酶濃度和消化時間對MSCs細(xì)胞周期的影響
            2.3.3.6 培養(yǎng)基對胰酶消化的MSCs增殖的影響
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第3章 HGF對MSCs增殖的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 無血清培養(yǎng)基的配制
        3.2.2 MSCs的培養(yǎng)
        3.2.3 MSCs的傳代
        3.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        3.2.5 細(xì)胞貼壁檢測
        3.2.6 細(xì)胞增殖檢測
        3.2.7 FAK抑制劑配制
        3.2.8 AKT抑制劑配制
        3.2.9 細(xì)胞周期檢測
        3.2.10 Western blot檢測
        3.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 HGF對MSCs增殖的影響
            3.3.1.1 HGF濃度對MSCs增殖的影響
            3.3.1.2 HGF對MSCs貼壁的影響
            3.3.1.3 HGF對MSCs增殖的影響
            3.3.1.4 HGF對MSCs細(xì)胞周期的影響
        3.3.2 HGF促進(jìn)MSCs增殖的相關(guān)機(jī)制
            3.3.2.1 HGF對MSCs增殖相關(guān)信號通路及整合素表達(dá)的影響
            3.3.2.2 HGF對AKT信號通路的影響
        3.3.3 HGF在FAK-AKT-mTOR信號通路及整合素表達(dá)中的作用
            3.3.3.1 PF對MSCs增殖的影響
            3.3.3.2 PF對FAK-AKT-mTOR信號通路及整合素表達(dá)的影響
            3.3.3.3 LY對MSCs增殖的影響
            3.3.3.4 LY對FAK-AKT-mTOR信號通路及整合素表達(dá)的影響
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第4章 HGF對MSCs細(xì)胞特性的影響
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 無血清培養(yǎng)基的配制
        4.2.2 MSCs的培養(yǎng)
        4.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        4.2.4 細(xì)胞增殖檢測
        4.2.5 生長曲線檢測
        4.2.6 表面表型檢測
        4.2.7 基因表型檢測
        4.2.8 成骨誘導(dǎo)分化
        4.2.9 成脂誘導(dǎo)分化
        4.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 HGF對MSCs形態(tài)的影響
        4.3.2 HGF對MSCs增殖的影響
        4.3.3 HGF對MSCs傳代的影響
        4.3.4 HGF對MSCs表面表型的影響
        4.3.5 HGF對MSCs干性基因表達(dá)的影響
        4.3.6 HGF對MSCs成骨分化潛能的影響
        4.3.7 HGF對MSCs成脂分化潛能的影響
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第5章 全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CD73對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與衰老的影響[J]. 王琰,李瓊,張三林,郭志坤.  解剖學(xué)報. 2017(06)
[2]動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研究與設(shè)計方法[J]. 王永民,陳昭烈.  中國生物工程雜志. 2007(01)



本文編號：3657541