間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是細(xì)胞治療和組織工程產(chǎn)品重要的種子細(xì)胞之一,由于從機(jī)體組織中獲取的MSCs數(shù)量有限,故需要進(jìn)行體外擴(kuò)增。MSCs體外擴(kuò)增受多種因素影響,如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)過(guò)程中的操作參數(shù)等。采用傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基擴(kuò)增MSCs,無(wú)法滿足臨床應(yīng)用的要求;而現(xiàn)有的化學(xué)成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基（Serum free medium,SFM）支持MSCs增殖的能力有限。針對(duì)上述問(wèn)題,本文以人臍帶來(lái)源的MSCs為研究對(duì)象,考察在無(wú)血清培養(yǎng)條件下胰酶濃度及消化時(shí)間對(duì)細(xì)胞收獲及繼代培養(yǎng)的影響,探究培養(yǎng)基關(guān)鍵組分肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor,HGF）對(duì)MSCs體外增殖的作用及潛在機(jī)制,以改善自制成分明確的SFM的促細(xì)胞增殖能力。研究結(jié)果表明,與含血清培養(yǎng)基相比,在商業(yè)化SFM和自制的SFM中MSCs的增殖和連續(xù)傳代能力較弱;低濃度、短時(shí)間的胰酶消化處理不利于細(xì)胞收獲;而高濃度、長(zhǎng)時(shí)間的胰酶消化處理破壞細(xì)胞表面整合素β1,導(dǎo)致細(xì)胞周期的延滯,從而對(duì)MSCs繼代培養(yǎng)時(shí)的黏附和增殖產(chǎn)生不良影響,因此選擇0.25%胰酶消化3 ... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
附錄
第1章 前言
    1.1 再生醫(yī)學(xué)與干細(xì)胞
        1.1.1 再生醫(yī)學(xué)與干細(xì)胞
        1.1.2 干細(xì)胞分類與應(yīng)用
    1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的特性
        1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源
            1.2.1.1 骨髓
            1.2.1.2 脂肪
            1.2.1.3 臍帶
        1.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用
    1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增
        1.3.1 細(xì)胞分離
        1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
            1.3.2.1 培養(yǎng)方式
            1.3.2.2 培養(yǎng)基
        1.3.3 細(xì)胞收獲
    1.4 培養(yǎng)基關(guān)鍵組分對(duì)MSCs生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)
        1.4.1 無(wú)血清培養(yǎng)基的組分
            1.4.1.1 糖類
            1.4.1.2 氨基酸
            1.4.1.3 脂質(zhì)
            1.4.1.4 維生素
            1.4.1.5 無(wú)機(jī)鹽
            1.4.1.6 細(xì)胞因子
        1.4.2 調(diào)節(jié)MSCs增殖的信號(hào)途徑
            1.4.2.1 MAPK途徑
            1.4.2.2 PI3K途徑
            1.4.2.3 NF-κB途徑
            1.4.2.4 JAK/STAT途徑
        1.4.3 無(wú)血清培養(yǎng)基的研究現(xiàn)狀及存在問(wèn)題
    1.5 課題提出
第2章 培養(yǎng)基和胰酶消化對(duì)MSCs增殖的影響
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制
        2.2.2 MSCs的培養(yǎng)
        2.2.3 MSCs的傳代
        2.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.2.5 細(xì)胞貼壁檢測(cè)
        2.2.6 細(xì)胞增殖檢測(cè)
        2.2.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        2.2.8 細(xì)胞存活率檢測(cè)
        2.2.9 細(xì)胞周期檢測(cè)
        2.2.10 Western blot檢測(cè)
        2.2.11 細(xì)胞表面表型檢測(cè)
        2.2.12 成骨誘導(dǎo)分化
        2.2.13 成脂誘導(dǎo)分化
        2.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 含血清培養(yǎng)基中MSCs的生長(zhǎng)和分化
            2.3.1.1 MSCs的形態(tài)與增殖
            3.3.1.2 MSCs的傳代培養(yǎng)
            2.3.1.3 MSCs的表面表型
            2.3.1.4 MSCs誘導(dǎo)分化
        2.3.2 無(wú)血清培養(yǎng)條件下MSCs的生長(zhǎng)和傳代
            2.3.2.1 MSCs的貼壁
            2.3.2.2 MSCs的增殖
            2.3.2.3 MSCs的連續(xù)傳代
        2.3.3 胰酶濃度和消化時(shí)間對(duì)MSCs繼代培養(yǎng)的影響
            2.3.3.1 胰酶濃度和消化時(shí)間對(duì)MSCs細(xì)胞收獲的影響
            2.3.3.2 胰酶濃度和消化時(shí)間對(duì)MSCs貼壁的影響
            2.3.3.3 胰酶濃度和消化時(shí)間對(duì)MSCs增殖的影響
            2.3.3.4 胰酶濃度和消化時(shí)間對(duì)MSCs整合素表達(dá)的影響
            2.3.3.5 胰酶濃度和消化時(shí)間對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響
            2.3.3.6 培養(yǎng)基對(duì)胰酶消化的MSCs增殖的影響
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第3章 HGF對(duì)MSCs增殖的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 無(wú)血清培養(yǎng)基的配制
        3.2.2 MSCs的培養(yǎng)
        3.2.3 MSCs的傳代
        3.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        3.2.5 細(xì)胞貼壁檢測(cè)
        3.2.6 細(xì)胞增殖檢測(cè)
        3.2.7 FAK抑制劑配制
        3.2.8 AKT抑制劑配制
        3.2.9 細(xì)胞周期檢測(cè)
        3.2.10 Western blot檢測(cè)
        3.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 HGF對(duì)MSCs增殖的影響
            3.3.1.1 HGF濃度對(duì)MSCs增殖的影響
            3.3.1.2 HGF對(duì)MSCs貼壁的影響
            3.3.1.3 HGF對(duì)MSCs增殖的影響
            3.3.1.4 HGF對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響
        3.3.2 HGF促進(jìn)MSCs增殖的相關(guān)機(jī)制
            3.3.2.1 HGF對(duì)MSCs增殖相關(guān)信號(hào)通路及整合素表達(dá)的影響
            3.3.2.2 HGF對(duì)AKT信號(hào)通路的影響
        3.3.3 HGF在FAK-AKT-mTOR信號(hào)通路及整合素表達(dá)中的作用
            3.3.3.1 PF對(duì)MSCs增殖的影響
            3.3.3.2 PF對(duì)FAK-AKT-mTOR信號(hào)通路及整合素表達(dá)的影響
            3.3.3.3 LY對(duì)MSCs增殖的影響
            3.3.3.4 LY對(duì)FAK-AKT-mTOR信號(hào)通路及整合素表達(dá)的影響
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第4章 HGF對(duì)MSCs細(xì)胞特性的影響
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 無(wú)血清培養(yǎng)基的配制
        4.2.2 MSCs的培養(yǎng)
        4.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        4.2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)
        4.2.5 生長(zhǎng)曲線檢測(cè)
        4.2.6 表面表型檢測(cè)
        4.2.7 基因表型檢測(cè)
        4.2.8 成骨誘導(dǎo)分化
        4.2.9 成脂誘導(dǎo)分化
        4.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 HGF對(duì)MSCs形態(tài)的影響
        4.3.2 HGF對(duì)MSCs增殖的影響
        4.3.3 HGF對(duì)MSCs傳代的影響
        4.3.4 HGF對(duì)MSCs表面表型的影響
        4.3.5 HGF對(duì)MSCs干性基因表達(dá)的影響
        4.3.6 HGF對(duì)MSCs成骨分化潛能的影響
        4.3.7 HGF對(duì)MSCs成脂分化潛能的影響
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第5章 全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CD73對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與衰老的影響[J]. 王琰,李瓊,張三林,郭志坤.  解剖學(xué)報(bào). 2017(06)
[2]動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究與設(shè)計(jì)方法[J]. 王永民,陳昭烈.  中國(guó)生物工程雜志. 2007(01)



本文編號(hào)：3657541