目的:篩選miR-20a-5p調(diào)控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p調(diào)控成骨分化的分子機(jī)制。方法:通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-20a-5p的靶基因,將靶基因的3′UTR及點(diǎn)突變序列插入熒光素酶或綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告載體中,并與miR-20a-5p的模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和GFP抑制實(shí)驗(yàn)檢測熒光素酶活性及GFP陽性細(xì)胞比例,確定miR-20a-5p與靶基因的靶向關(guān)系。結(jié)果:通過生物信息學(xué)預(yù)測到Smad7是miR-20a-5p的靶基因,miR-20a-5p在不同物種的Smad7基因3′UTR區(qū)都有保守的結(jié)合種子序列;熒光素酶、GFP報(bào)告基因及點(diǎn)突變載體經(jīng)PCR及測序鑒定均正確;雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示:miR-20a-5p顯著降低Smad7 3′UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性;GFP抑制實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:miR-20a-5p可以顯著降低GFP陽性細(xì)胞的比例。結(jié)論:miR-20a-5p可以直接靶作用于Smad7 3′UTR的種子序列,提示其可能通過直接靶向Smad7基因來發(fā)揮促進(jìn)成骨分化的調(diào)控作用。 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,26(03)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        1.2.2 cDNA的獲取
        1.2.3 靶基因的預(yù)測
        1.2.4 miR-20a-5p靶基因熒光報(bào)告載體的構(gòu)建
        1.2.5 miR-20a-5p靶基因綠色熒光（GFP）報(bào)告載體的構(gòu)建
        1.2.6 雙熒光素酶檢測
        1.2.7 GFP抑制實(shí)驗(yàn)
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 miR-20a-5p靶基因預(yù)測
    2.2 熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
    2.3 GFP報(bào)告基因載體的構(gòu)建
    2.4 雙熒光素酶活性檢測
    2.5 GFP抑制實(shí)驗(yàn)
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Nfic基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與miR-20a靶向關(guān)系的驗(yàn)證[J]. 王珊,李曉霞,周杰,王寶利.  天津醫(yī)藥. 2016(09)
[2]骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 張?jiān)录t.  解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志. 2004(02)



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