發(fā)布時(shí)間：2022-02-15 02:06

　　線粒體擁有自身的基因組（mtDNA）,在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe,S.pombe）中,mtDNA編碼氧化磷酸化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶,因此mtDNA的正常表達(dá)對(duì)線粒體功能的發(fā)揮至關(guān)重要。PPR蛋白是一類主要調(diào)控細(xì)胞器基因表達(dá)的蛋白家族,粟酒裂殖酵母的Ppr10蛋白是PPR家族中的一員,主要參與mtDNA編碼的呼吸鏈蛋白的合成,與線粒體的功能緊密相關(guān)。PPR模體是由35個(gè)連續(xù)排列的氨基酸組成的重復(fù)單位,Ppr10具有兩個(gè)PPR模體,這兩個(gè)模體對(duì)Ppr10正常發(fā)揮功能必不可少。利用蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件HHrep ID進(jìn)一步分析Ppr10的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),該蛋白具有13個(gè)重復(fù)序列,這些序列均富含亮氨酸等疏水性氨基酸且不保守,與PPR模體特征相似,因此本文中將其命名為類PPR模體并對(duì)其功能進(jìn)行研究。首先構(gòu)建單個(gè)類PPR模體缺失菌并將其命名為ppr10?1-ppr10?13。表型研究結(jié)果表明,單個(gè)缺失類PPR模體1-7導(dǎo)致線粒體功能嚴(yán)重受損,而缺失類PPR模體8會(huì)部分影響線粒體功能或者影響不顯著,且單個(gè)缺失類PPR模體1-7和10導(dǎo)致細(xì)胞在穩(wěn)定期后期大量死亡。利用免疫印跡方... 

【文章來(lái)源】：南京師范大學(xué)江蘇省211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

各類型PPR蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[44]

第二章粟酒裂殖酵母中Ppr10類PPR模體缺失后表型的研究10圖2.1菌種構(gòu)建示意圖A：Ppr10蛋白結(jié)構(gòu)圖；B：菌株的構(gòu)建示意圖；MTS：線粒體定位序列；PPR模體在7號(hào)和8號(hào)類PPR模體的位置。Figure2.1SchematicdiagramofstrainconstructionA:Ppr10proteinstructure;B:Schematicdiagramofstrainconstruction;MTS:mitochondriallocalizationsequence;PPRmotifislocatedatNo.7andNo.8repeat.2.1.2所用試劑及耗材蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、酵母粉、腺嘌呤、尿嘧啶、精氨酸、組氨酸均購(gòu)自上海生工生物公司，PrimerStar酶、連接酶、各種限制性內(nèi)切酶、鮭魚精、潮霉素和RNaseA購(gòu)自Sigma，引物合成及測(cè)序工作由上海生工生物公司完成，Tris、EDTA、NaOH、醋酸鈉、醋酸鋰及PEG購(gòu)于丁貝公司，常用試劑及分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥試劑公司與上海生工生物公司。2.1.3培養(yǎng)基與試劑配制1.培養(yǎng)基（1）YES（YeastExtractwithsupplements）培養(yǎng)基（1L）葡萄糖（glucose）30g酵母粉（yeastextract）5g腺嘌呤（adenine）0.225g組氨酸（histidine）0.225g尿嘧啶（uracil）0.225g亮氨酸（leucine）0.225g

第二章粟酒裂殖酵母中Ppr10類PPR模體缺失后表型的研究132.1.4引物序列表2.1本章所用引物Table2.1Primersusedinthischapter引物名稱引物序列ppr10-up-BamHICGCGGATCCATCTTTATAGCCCCAAAACTCppr10-13-U-dwTTTAATCTTAGATGCGAAGGTTTTTTCppr10-13-D-upGAAAAAACCTTCGCATCTAAGATTAAAACTCTGGATGAGATAGCS-13-dwTCGCTTATTTAGAAGTGGppr10-dw-SmaITCCCCCGGGATAGTTAAAGCATCTATAAACGACppr10-dw-cxCACCGTTAATTAACCCGGG2.1.5質(zhì)粒圖譜本章中所用的質(zhì)粒為Pppr10-ppr10，該質(zhì)粒由整合型質(zhì)粒pJK148改造而來(lái)，該質(zhì)粒的啟動(dòng)子為ppr10基因的自身啟動(dòng)子，目的片段插入到BamHI和SmaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間可將質(zhì)粒上的ppr10基因置換從而得到想要的質(zhì)粒。質(zhì)粒圖譜如圖2.2所示。圖2.2Pppr10-ppr10質(zhì)粒示意圖Figure2.2TheSchematicofPppr10-ppr10plasmidmap


本文編號(hào)：3625697