谷氨酸棒桿菌擁有無(wú)內(nèi)毒素、易實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白胞外分泌、胞外水解酶活性較低以及內(nèi)源蛋白幾乎不分泌等特點(diǎn),是較為理想的外源蛋白表達(dá)宿主。但目前在谷氨酸棒桿菌中可利用的蛋白表達(dá)載體相對(duì)較少,開發(fā)新型高效表達(dá)載體對(duì)谷氨酸棒桿菌的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。本課題針對(duì)這些問(wèn)題,做了如下研究。通過(guò)鑒定谷氨酸棒桿菌高表達(dá)基因5’UTR及其下游序列并將其分別構(gòu)建單、雙順?lè)醋颖磉_(dá)組件,初步篩選了多個(gè)高強(qiáng)度的表達(dá)載體。首先,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在谷氨酸棒桿菌中依據(jù)內(nèi)源蛋白表達(dá)豐度的高低我們篩選了 12個(gè)基因,并通過(guò)5’RACE實(shí)驗(yàn)成功鑒定了這12個(gè)基因的5’UTR及其下游序列,其中9個(gè)基因具有5’UTR序列,而另外3個(gè)基因則缺少5’UTR序列。將不同的5’UTR序列與組成型啟動(dòng)子PH36組合成新的單順?lè)醋颖磉_(dá)組件 pH36-UTR,以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）作為報(bào)告蛋白,發(fā)現(xiàn)5’UTR能夠顯著影響著PH36啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性以及蛋白的翻譯效率。隨后將5’UTR及其下游62 bp序列與啟動(dòng)子PH36組成雙順?lè)醋颖磉_(dá)組件pH36-BUTR,與單順?lè)醋酉?.. 

【文章來(lái)源】：江南大學(xué)江蘇省211工程院校教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

功能性基因表達(dá)組件包含了啟動(dòng)子和5"UTR序列

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文8圖1-2原核生物中多順?lè)醋踊虮磉_(dá)調(diào)控策略Fig.1-2PolycistronicgeneexpressioninProkaryotes1.3.2雙順?lè)醋硬呗栽诠劝彼岚魲U菌中表達(dá)載體開發(fā)的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸棒桿菌中的雙順?lè)醋颖磉_(dá)模型比單順?lè)醋颖磉_(dá)模型能夠顯著提高外源蛋白的表達(dá)能力[41]。如圖1-3所示，啟動(dòng)子與基因5"UTR組成單順?lè)醋颖磉_(dá)模型，啟動(dòng)子與基因5"UTR及其下游62bp和保守SD序列（AAAGGAGGACAACTAATG）組成雙順?lè)醋颖磉_(dá)模型，核糖體啟動(dòng)前順?lè)醋臃g后，直接起始下游mRNA的翻譯，使得核糖體能夠在SD2區(qū)聚集，極大地增加后一個(gè)基因mRNA的翻譯效率，從而提高了外源蛋白的表達(dá)水平。圖1-3谷氨酸棒桿菌中雙順?lè)醋颖磉_(dá)組件Fig.1-3bicistronicexpressionmodelinC.glutamicum1.4谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)外源蛋白谷氨酸棒桿菌展現(xiàn)了優(yōu)異的外源蛋白表達(dá)能力，受到了越來(lái)越多研究者的重視，近些年已經(jīng)成功地在谷氨酸棒桿菌中實(shí)現(xiàn)了多種異源蛋白的高效表達(dá)，例如Liu等人利用谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)淀粉酶，產(chǎn)量達(dá)到103.5mgL-1；Yim等人通過(guò)谷氨酸棒桿菌成功實(shí)現(xiàn)單鏈抗體（singlechainantibodyfragment,scFv）的高效表達(dá)。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文8圖1-2原核生物中多順?lè)醋踊虮磉_(dá)調(diào)控策略Fig.1-2PolycistronicgeneexpressioninProkaryotes1.3.2雙順?lè)醋硬呗栽诠劝彼岚魲U菌中表達(dá)載體開發(fā)的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸棒桿菌中的雙順?lè)醋颖磉_(dá)模型比單順?lè)醋颖磉_(dá)模型能夠顯著提高外源蛋白的表達(dá)能力[41]。如圖1-3所示，啟動(dòng)子與基因5"UTR組成單順?lè)醋颖磉_(dá)模型，啟動(dòng)子與基因5"UTR及其下游62bp和保守SD序列（AAAGGAGGACAACTAATG）組成雙順?lè)醋颖磉_(dá)模型，核糖體啟動(dòng)前順?lè)醋臃g后，直接起始下游mRNA的翻譯，使得核糖體能夠在SD2區(qū)聚集，極大地增加后一個(gè)基因mRNA的翻譯效率，從而提高了外源蛋白的表達(dá)水平。圖1-3谷氨酸棒桿菌中雙順?lè)醋颖磉_(dá)組件Fig.1-3bicistronicexpressionmodelinC.glutamicum1.4谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)外源蛋白谷氨酸棒桿菌展現(xiàn)了優(yōu)異的外源蛋白表達(dá)能力，受到了越來(lái)越多研究者的重視，近些年已經(jīng)成功地在谷氨酸棒桿菌中實(shí)現(xiàn)了多種異源蛋白的高效表達(dá)，例如Liu等人利用谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)淀粉酶，產(chǎn)量達(dá)到103.5mgL-1；Yim等人通過(guò)谷氨酸棒桿菌成功實(shí)現(xiàn)單鏈抗體（singlechainantibodyfragment,scFv）的高效表達(dá)。


本文編號(hào)：3625277