發(fā)布時間：2022-01-07 13:47

　　南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）是具有α/β水解酶折疊的絲氨酸水解酶。因其出色的催化性能,在食品、化工、能源等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。然而野生型CALB較差的熱穩(wěn)定性使其在實際的生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。為提高CALB的熱穩(wěn)定性,拓展CALB在工業(yè)中的應(yīng)用,本論文采用理性設(shè)計結(jié)合固定化策略改造CALB,成功提高了CALB的熱穩(wěn)定性。此外,通過補料分批發(fā)酵,成功提高了CALB于畢赤酵母中的表達(dá)量。具體包括:（1）根據(jù)軟件PoPMuSiC和FoldX計算各個位點突變后自由能的變化,以及氨基酸殘基的空間位置,選擇CALB潛在的熱穩(wěn)定性突變位點。經(jīng)實驗驗證,突變位點A146G、A151P和L278M均能有效提高CALB的熱穩(wěn)定性。將這3個點突變進行組合后,組合突變體的熱穩(wěn)定性得到了進一步的提高,其中A146G-L278M在50°C的半衰期t_1/2為6.28 h,是野生型的1.35倍,T_m值提高了3.3°C,最適反應(yīng)溫度為50°C,比野生型提高了5°C,比活為野生型的2倍,動力學(xué)參數(shù)測定表明其在酯合成反應(yīng)中... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

本論文研究思路流程圖

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文14表2.4用于構(gòu)建定點突變質(zhì)粒的引物表Table2.4Listofprimersforconstructingsite-directedmutantplasmids引物名稱序列(5’→3’)calb-FAATTGAATTCTTGCCATCTGGTTCTGATCCTGcalb-RAATTGCGGCCGCTTAAGGAGTAACAS50RATCTTTTGATAGAAACTGGATTCCATTGTS56MGATTCCATTGATGACTCAATTGGGTTACQ112LGTTTGGTTGCTTTGTGGGGTTTGA130CATAGATTGATGTGTTTTGCTCCTGA146GTGGTCCATTGGATGGTTTGGCTGTTTA151PGGCTGTTTCTCCACCTTCTGTTN181VGTTCCAACTACTGTTTTGTACTCTGCTG226RTTGATCATGCTAGATCTTTGACTN264PCTTTGCCAGCTCCAGATTTGACTCCL278MTGCTGCTTTGATGGCTCCAGT180CCGTTCCAACTTGTAATTTGTACTCTGCTA240CGTTGGTAGATCTTGTTTGAGATCTAC注：標(biāo)注下劃線的堿基為突變位點，用于定點突變的引物的正反向完全互補。圖2-1GS115-calb菌株構(gòu)建流程圖Fig.2-1TheflowdiagramofconstructingGS115-calbstrain2.2.4更換信號肽菌株畢赤酵母GS115-calb-N的構(gòu)建為提高CALB的表達(dá)量，將質(zhì)粒pPICZαA-calb上的α-因子信號肽更換成CALB在南極假絲酵母中的原有的信號肽，采用重疊延伸技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒pPICZαA-calb-N。構(gòu)建流程如圖2-2所示。

第二章實驗材料與方法15圖2-2重組質(zhì)粒pPICZαA-calb-N構(gòu)建流程圖Fig.2-2TheflowdiagramofconstructingrecombinantplasmidofpPICZαA-calb-N根據(jù)CALB及其自身信號肽的序列[82]，引物設(shè)計如表2.5所示。采用重疊延伸將信號肽添加到基因calb中，獲得基因calb-N。隨后采用BstBI、NotI對載體pPICZαA和基因calb-N進行雙酶切，在T4ligationenzyme作用下連接片段pPICZαA和calb-N，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109，余下具體步驟參照方法2.2.3，完成表達(dá)菌株GS115-calb-N的構(gòu)建。表2.5構(gòu)建pPICZαA-calb-N質(zhì)粒的引物表Table2.5ListofprimersforconstructingplasmidofpPICZαA-calb-N引物名稱序列(5’→3’)SP-1AATTGAATTCTCTCTTAACCAATGGAGTAGCAGCAACACAAGTAGCCAAAACACCAGCAACACCSP-2GCCAAAACACCAGCAACACCAGTCAAAGACAACAACTTCATCGTTTCGAATSP-3AGACAACAACTTCATCGTTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTGATCTTCTC2.2.5雙啟動子菌株的構(gòu)建本實驗室保藏的質(zhì)粒pGAP-EGFP是以GAP為啟動子表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP的重組質(zhì)粒，將其中的EGFP基因替換成calb基因，即構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAP-calb。具體操作流程如圖2-3。根據(jù)質(zhì)粒pGAP-EGFP和基因calb的序列，設(shè)計具有同源臂的引物，具體引物設(shè)計見表2.6。PCR擴增得到末端互補配對的載體pGAP和基因calb，PCR產(chǎn)物回收純化后，采用一步克隆試劑盒ClonExpressMultiSOneStepCloningKit連接目的片段和載體，構(gòu)建得重組質(zhì)粒pGAP-calb。為構(gòu)建同時含有組成型啟動子GAP和誘導(dǎo)型啟動子AOX的雙啟動子菌株，將前期構(gòu)建的含AOX啟動子的菌株GS115-calb制備成感受態(tài)細(xì)胞。將含GAP啟動子的重組質(zhì)粒pGAP-calb采用限制性內(nèi)切酶AvrII線性化后，電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入GS115-calb感受態(tài)細(xì)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]應(yīng)用雙啟動子共表達(dá)體系提高人胰島素原在畢赤酵母中的表達(dá)量[J]. 李紅亮,陳勇,陳海容,黃程,馮一建,梅翔,何躍,范開.  中國生物制品學(xué)雜志. 2012(04)

博士論文
[1]介孔氧化硅固定化脂肪酶及其非水相催化應(yīng)用[D]. 靳文斌.江南大學(xué) 2019
[2]計算機輔助分子設(shè)計提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究[D]. 田健.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011



本文編號：3574659