發(fā)布時(shí)間：2021-11-18 04:43

　　目的:CRISPR/Cas9是目前運(yùn)用最廣泛以RNA為引導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng),具有核酸內(nèi)切酶功能。與其類似的Ago2蛋白在5’磷酸化或羥基化修飾的gDNA引導(dǎo)下也具有核酸內(nèi)切酶功能。然而Ago蛋白僅在高溫發(fā)揮作用這一特點(diǎn)限制了其在哺乳動(dòng)物中的運(yùn)用。最近有新的報(bào)道表明Ago蛋白家族中的NgAgo蛋白在37℃可能降解RNA。本研究旨在探討NgAgo-gDNA基因編輯技術(shù)在體外和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的編輯能力,并鑒定其新的切割位點(diǎn)。方法:1.體外切割實(shí)驗(yàn):采用雙酶切的方法構(gòu)建pET-24a（+）-NgAgo原核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株中進(jìn)行表達(dá)。通過IPTG誘導(dǎo)pET-24a（+）-NgAgo陽性菌株的表達(dá),并純化NgAgo蛋白;設(shè)計(jì)與被切割靶標(biāo)RNA反向互補(bǔ)并以5’端磷酸化或羥基化修飾的gDNA;用體外轉(zhuǎn)錄的方式合成靶標(biāo)RNA:GFP-RNA、HCV-RNA1和HCV-RNA2;設(shè)計(jì)切割反應(yīng),在體外進(jìn)行NgAgo-gDNA切割靶標(biāo)RNA的實(shí)驗(yàn)。收集并純化切割體系中的總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,驗(yàn)證NgAgo-gDNA的切割位點(diǎn)。2.細(xì)胞內(nèi)切割實(shí)驗(yàn):構(gòu)建pc... 

【文章來源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

左為空載體pET-24a（+），右為空載體pcDNA3.1（-）

第三章 結(jié)果-24a（+）-NgAgo 原核表達(dá)載體4a（+）作為原核表達(dá)載體，合成 NgAgo 編碼序和 NgAgo 編碼序列同時(shí)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物NgAgo 原核表達(dá)質(zhì)粒。將原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑 pET-24a（+）-NgAgo 陽性重組質(zhì)粒。用 EcoR進(jìn)行雙酶切鑒定。雙酶切后的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠：NgAgo 編碼序列長度為 2840bp，在目的位置于 pET-24a（+）-NgAgo 重組質(zhì)粒大小。結(jié)果顯粒構(gòu)建成功。

圖 2：NgAgo 蛋白的驗(yàn)證（A）考馬斯亮藍(lán)染色。M1為蛋白 Marker、1 為 BSA 蛋白、2 為 NgAgo 蛋白泳道，箭頭所指即為 NgAgo 蛋白位置；（B）蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)。M2為蛋白 Marker、3 為 NgAgo 蛋白，箭頭所指即為 NgAgo 蛋白位置。3.3 NgAgo-gDNA 對(duì) DNA 無編輯作用3.3.1 NgAgo-gDNA 可減少細(xì)胞內(nèi) GFP 熒光數(shù)將NgAgo、gDNA和GFP共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。觀察GFP表達(dá)情況（圖3-1.A），與對(duì)照組相比，NgAgo 和 5’P-FW-gDNA 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞組的 GFP 熒光蛋白表達(dá)降低。GFP 熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析（圖 3-1.B ）顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。


本文編號(hào)：3502231