目的:探討PKCα在TOCP影響SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞自噬的作用及機(jī)制。方法:1.SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)TOCP（0¹ mmol/L）染毒,通過MTT法測定該化合物對細(xì)胞增殖的影響,并利用SPSS軟件算出SK-N-SH細(xì)胞暴露于TOCP（48 h）的半數(shù)抑制濃度（IC50）,并確定后期實驗的染毒劑量。2.SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)TOCP（0¹ mmol/L）染毒,通過熒光分光光度儀測定細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性,Western blot檢測PKCα蛋白、pPKCα蛋白、自噬蛋白（P62、Beclin 1、LC3II/LC3I）、自噬受體蛋白（OPTN、NBR1）、細(xì)胞骨架蛋白（p-Tau、NF-H、MAP2）和泛素化蛋白（Ub）表達(dá)水平。使用了透射電子顯微鏡觀察自噬體的生成情況。3.SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)PKCα激活劑（PMA）和抑制劑（SP）預(yù)處理0.5 h后,0.75 mmol/L TOCP染毒48 h,過熒光分光光度儀測定細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性,Western blot檢測PKCα蛋白、p-PKCα蛋白、自噬蛋白（P62、Beclin 1、LC3II/LC... 

【文章來源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

TOCP對SK-N-SH細(xì)胞增殖影響

119一方面，在用TOCP（0.75mM）處理的SK-N-SH細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到一些自噬泡，其中包含了大量被自噬降解的細(xì)胞器，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。以上結(jié)果表明TOCP處理可抑制SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)的自噬流。圖3.2不同濃度的TOCP處理SK-N-SH細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62和LC3II/I表達(dá)水平影響A：SK-N-SH細(xì)胞Beclin1、P62和LC3II/IWB結(jié)果圖；B:Beclin1蛋白灰度值分析；C：P62灰度值分析；D：LC3II/I蛋白灰度值分析；與對照組比較，*:P<0.05，n=3（E）透射電子顯微鏡圖像，描繪了對照和TOCP（0.75mM）處理48小時的SK-N-SH細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。黑色箭頭，自噬泡。白色箭頭，液泡。比例尺：1μm。

203.3TOCP對SK-N-SH細(xì)胞PKCα活性的影響為了研究TOCP和PKCα的相關(guān)性，SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)TOCP（0~1mmol/L）處理的SK-N-SH細(xì)胞，WB檢測p-PKCα、PKCα和對照GAPDH的表達(dá)（圖3.3A）。如圖3.3B所示，在經(jīng)不同濃度TOCP處理的SK-N-SH細(xì)胞中，p-PKCα/PKCα呈明顯的劑量依賴性增加。隨后，我們進(jìn)一步研究SK-N-SH細(xì)胞分別經(jīng)PKCα激活劑（PMA）和抑制劑（SP）預(yù)處理0.5h后，0.75mmol/LTOCP染毒48h，WB檢測了p-PKCα，PKCα和對照GAPDH的表達(dá)（圖3.3C）。對每個條帶灰度值分析之后，我們發(fā)現(xiàn)相比于對照組，TOCP，PMA和TOCP+PMA組中p-PKCα/PKCα增加，而SP和SP+TOCP組中p-PKCα/PKCα下降（圖3.3D）。并使用了免疫熒光法測定PKCα蛋白（見圖3.3E）表達(dá)水平來進(jìn)一步驗證WB的結(jié)果。以上數(shù)據(jù)表明TOCP能激活人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞中的PKCα活性。圖3.3TOCP對細(xì)胞內(nèi)PKCα活性影響（A）p-PKCα和PKCα蛋白WB結(jié)果圖；（B）p-PKCα/PKCα蛋白灰度值分析；（C）p-PKCα和PKCα蛋白WB結(jié)果圖；（D）p-PKCα/PKCα灰度值分析；與陰性對照組比較，*：P<0.05；#：與TOCP組比較P<0.05，n=3。（E）PKCα免疫熒光；

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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