釀酒酵母中基于CRISPR/dCas9的基因轉錄調控工具的開發(fā)與應用
發(fā)布時間：2021-10-22 15:19
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是重要的模式真核微生物,廣泛用于基礎研究和工業(yè)發(fā)酵�；贑RISPR/dCas9系統(tǒng)開發(fā)的轉錄調控方法具有可編程、多重性和正交性等優(yōu)點,在釀酒酵母的基因調控、功能基因組學、代謝工程等研究領域具有巨大潛力。本文關注釀酒酵母中CRISPR/dCas9基因轉錄調控工具的研究進展,闡述了不同轉錄調節(jié)結構域對dCas9或gRNA活性的調節(jié),設計與優(yōu)化dCas9和gRNA表達的方法,影響CRISPR/dCas9系統(tǒng)轉錄調控效率、特異性和通量的靶向性因素,最后總結了該工具在釀酒酵母代謝工程中的應用,并對該技術的未來發(fā)展提出了展望。
【文章來源】：生物技術通報. 2020,36(04)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：12 頁
【部分圖文】：
利用多條gRNA進行協(xié)同、多重或多模式轉錄調控
調節(jié)gRNA的轉錄水平也是優(yōu)化CRISPR/dCas9轉錄調控性能的重要方法。首先,利用不同類型的天然啟動子可以用來調節(jié)gRNA的轉錄水平。與RNA聚合酶相對應,真核生物啟動子可分為I型(rRNA)、II型(mRNA)和III型(snoRNA、tRNA等)。由于II型啟動子會在gRNA的5"和3"端添加額外的核苷酸從而干擾其正常功能,因此一般利用III型啟動子驅動gRNA的表達,如PSNR52和PRPR1等[6,21,23]（表1）。然而，由于III型啟動子的轉錄本長度較短，為了提高gRNA設計和表達的靈活性，Gao等[52]通過在gRNA兩端分別融合錘頭型核酶（Hammerhead-type ribozymes）和HDV核酶（Hepatitis delta virus）在釀酒酵母細胞中實現(xiàn)了由II型PADH1啟動子驅動的gRNA的表達（表1）。這種含有核酸酶的g RNA稱為RGR(Ribozyme-flanked gRNA）�；谠撛O計，Deaner等[18]利用II型的PTEF1啟動子將gRNA的轉錄水平比III型的PSNR52啟動子提高了3.88倍，顯著提高了dCas9-VPR介導的轉錄抑制效率（gRNA靶點的位置效應，見下文）。而Gander等[53]利用最小化PCYC1啟動子驅動RGR的轉錄，基于dCas9-Mxi1建立的非邏輯門顯示了最小的泄漏并具有數(shù)字響應，為更加復雜的遺傳電路研究奠定了基礎。除組成型啟動子外，還可以改造天然的III型啟動子使其具有對環(huán)境因素變化響應的能力，從而增強dCas9調控工具的可控性。例如，研究人員通過在III型PRPR1啟動子中整合Tet操縱子結合位點，實現(xiàn)無水四環(huán)素對gRNA的誘導轉錄，以及2-20倍的轉錄調控動態(tài)范圍[21,38,42,54]。這些不同啟動子驅動的多種設計方案為gRNA的表達量、通量和對gRNA表達的控制提供了有力的工具和多樣的選擇。1.3 針對靶向性能的設計與優(yōu)化
與dCas9融合多個轉錄調控蛋白結構域或gRNA融合多個適配子的思路類似,靶向同一目的基因的多條gRNA能夠協(xié)同調控靶基因的轉錄(圖3-A)。Farzadfard等[21]組合使用兩條gRNA時將轉錄抑制的效率從2倍提高到了7倍,Deaner等[18]同樣利用兩條gRNA提高了dCas9-VPR介導的轉錄抑制水平。此外,還可以通過在啟動子內人工合成相同的靶序列,實現(xiàn)多條單一gRNA介導的協(xié)同調控。Farzadfard等[21]利用含有12個gRNA結合位點的合成型啟動子,將dCas9-VP64介導的轉錄激活提高了70倍,Gilbert等[23]利用含有7個Tet操縱子結合位點的合成型啟動子,將dCas9介導的轉錄抑制提高了115倍。利用靶向多個目的基因的多條gRNA或scRNA可實現(xiàn)多重性(Multiplex)的轉錄調控(圖3-B)。Jensen等[38]利用dCas9與scRNA將Mxi1和VPR等轉錄調控結構域靶向類胡蘿卜素和三酰甘油生物合成途徑的多個基因,顯著增加了相關產(chǎn)物的產(chǎn)量。Ferreira等[54]利用來自綠膿假單胞菌的核糖核酸內切酶Csy4,實現(xiàn)了PRPR1啟動子驅動單條轉錄本中3個gRNA的轉錄和釋放,實現(xiàn)了同時對OLE1,HGM1和ACS1等多個基因進行轉錄調控。此外,基于CRISRP/dCas9工具中組成元件相互作用的特異性,可以設計彼此正交的gRNA,在同一細胞中對多個目標基因實現(xiàn)不同模式的基因調控。例如,利用不同RNA適配子與其結合蛋白的特異性識別,Zalatan等[39]設計彼此正交、與不同轉錄調控因子結合的scRNA序列(圖3-B),在同一菌株中對紫色桿菌素合成通路的不同分支的基因進行轉錄抑制和轉錄激活,通過調控代謝流實現(xiàn)了不同產(chǎn)物的定向合成。利用不同Cas蛋白識別不同PAM序列的特點,Lian等[19]測試了不同來源的dCas蛋白和多種轉錄激活或抑制結構域的組合,構建了基于dLbCpf1-VP、dSpCas9-RD1152和SaCas9的釀酒酵母三相基因調控策略,稱為CRISPR-AID(Transcriptional Activation,transcriptional Interference,and gene Deletion)。作者設計了彼此正交、與不同Cas蛋白對應的gRNA序列(圖3-C),在同一細胞中可以實現(xiàn)對多個目的基因進行轉錄抑制、轉錄激活、基因敲除等不同模式的調控。綜上,多重gRNA的設計與使用能夠提高單個靶基因的轉錄調控能力,實現(xiàn)多個靶基因的單向多重調控,還能夠利用正交性設計系統(tǒng)實現(xiàn)靶基因的多重和多模式調控。通過增加可同時操作的基因靶點和調控模式,有助于從多個工程化改造靶點中快速找到最優(yōu)的調控策略及其組合,即利用組合式優(yōu)化為復雜基因線路、合成途徑和細胞代謝的設計和改造提供有力工具。
本文編號：3451363
【文章來源】：生物技術通報. 2020,36(04)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：12 頁
【部分圖文】：
利用多條gRNA進行協(xié)同、多重或多模式轉錄調控
調節(jié)gRNA的轉錄水平也是優(yōu)化CRISPR/dCas9轉錄調控性能的重要方法。首先,利用不同類型的天然啟動子可以用來調節(jié)gRNA的轉錄水平。與RNA聚合酶相對應,真核生物啟動子可分為I型(rRNA)、II型(mRNA)和III型(snoRNA、tRNA等)。由于II型啟動子會在gRNA的5"和3"端添加額外的核苷酸從而干擾其正常功能,因此一般利用III型啟動子驅動gRNA的表達,如PSNR52和PRPR1等[6,21,23]（表1）。然而，由于III型啟動子的轉錄本長度較短，為了提高gRNA設計和表達的靈活性，Gao等[52]通過在gRNA兩端分別融合錘頭型核酶（Hammerhead-type ribozymes）和HDV核酶（Hepatitis delta virus）在釀酒酵母細胞中實現(xiàn)了由II型PADH1啟動子驅動的gRNA的表達（表1）。這種含有核酸酶的g RNA稱為RGR(Ribozyme-flanked gRNA）�；谠撛O計，Deaner等[18]利用II型的PTEF1啟動子將gRNA的轉錄水平比III型的PSNR52啟動子提高了3.88倍，顯著提高了dCas9-VPR介導的轉錄抑制效率（gRNA靶點的位置效應，見下文）。而Gander等[53]利用最小化PCYC1啟動子驅動RGR的轉錄，基于dCas9-Mxi1建立的非邏輯門顯示了最小的泄漏并具有數(shù)字響應，為更加復雜的遺傳電路研究奠定了基礎。除組成型啟動子外，還可以改造天然的III型啟動子使其具有對環(huán)境因素變化響應的能力，從而增強dCas9調控工具的可控性。例如，研究人員通過在III型PRPR1啟動子中整合Tet操縱子結合位點，實現(xiàn)無水四環(huán)素對gRNA的誘導轉錄，以及2-20倍的轉錄調控動態(tài)范圍[21,38,42,54]。這些不同啟動子驅動的多種設計方案為gRNA的表達量、通量和對gRNA表達的控制提供了有力的工具和多樣的選擇。1.3 針對靶向性能的設計與優(yōu)化
與dCas9融合多個轉錄調控蛋白結構域或gRNA融合多個適配子的思路類似,靶向同一目的基因的多條gRNA能夠協(xié)同調控靶基因的轉錄(圖3-A)。Farzadfard等[21]組合使用兩條gRNA時將轉錄抑制的效率從2倍提高到了7倍,Deaner等[18]同樣利用兩條gRNA提高了dCas9-VPR介導的轉錄抑制水平。此外,還可以通過在啟動子內人工合成相同的靶序列,實現(xiàn)多條單一gRNA介導的協(xié)同調控。Farzadfard等[21]利用含有12個gRNA結合位點的合成型啟動子,將dCas9-VP64介導的轉錄激活提高了70倍,Gilbert等[23]利用含有7個Tet操縱子結合位點的合成型啟動子,將dCas9介導的轉錄抑制提高了115倍。利用靶向多個目的基因的多條gRNA或scRNA可實現(xiàn)多重性(Multiplex)的轉錄調控(圖3-B)。Jensen等[38]利用dCas9與scRNA將Mxi1和VPR等轉錄調控結構域靶向類胡蘿卜素和三酰甘油生物合成途徑的多個基因,顯著增加了相關產(chǎn)物的產(chǎn)量。Ferreira等[54]利用來自綠膿假單胞菌的核糖核酸內切酶Csy4,實現(xiàn)了PRPR1啟動子驅動單條轉錄本中3個gRNA的轉錄和釋放,實現(xiàn)了同時對OLE1,HGM1和ACS1等多個基因進行轉錄調控。此外,基于CRISRP/dCas9工具中組成元件相互作用的特異性,可以設計彼此正交的gRNA,在同一細胞中對多個目標基因實現(xiàn)不同模式的基因調控。例如,利用不同RNA適配子與其結合蛋白的特異性識別,Zalatan等[39]設計彼此正交、與不同轉錄調控因子結合的scRNA序列(圖3-B),在同一菌株中對紫色桿菌素合成通路的不同分支的基因進行轉錄抑制和轉錄激活,通過調控代謝流實現(xiàn)了不同產(chǎn)物的定向合成。利用不同Cas蛋白識別不同PAM序列的特點,Lian等[19]測試了不同來源的dCas蛋白和多種轉錄激活或抑制結構域的組合,構建了基于dLbCpf1-VP、dSpCas9-RD1152和SaCas9的釀酒酵母三相基因調控策略,稱為CRISPR-AID(Transcriptional Activation,transcriptional Interference,and gene Deletion)。作者設計了彼此正交、與不同Cas蛋白對應的gRNA序列(圖3-C),在同一細胞中可以實現(xiàn)對多個目的基因進行轉錄抑制、轉錄激活、基因敲除等不同模式的調控。綜上,多重gRNA的設計與使用能夠提高單個靶基因的轉錄調控能力,實現(xiàn)多個靶基因的單向多重調控,還能夠利用正交性設計系統(tǒng)實現(xiàn)靶基因的多重和多模式調控。通過增加可同時操作的基因靶點和調控模式,有助于從多個工程化改造靶點中快速找到最優(yōu)的調控策略及其組合,即利用組合式優(yōu)化為復雜基因線路、合成途徑和細胞代謝的設計和改造提供有力工具。
本文編號：3451363
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