【背景】表達載體是基因工程必不可少的工具,對于真菌如里氏木霉（Trichoderma reesei）等,由于缺乏商品化的表達載體,使其基因工程蛋白表達既復雜又費時而難以開展�！灸康摹拷⒁环N利用URA3序列快速構(gòu)建表達載體的方法,解決真菌研究中難以簡單、高效和快速構(gòu)建表達載體的難題。【方法】基于URA3基因的序列,利用其啟動子上游5′端序列和終止子下游3′端序列構(gòu)建同源重組臂,通過同源重組臂定向同源重組到宿主基因組上,利用強啟動子和終止子替換URA3基因,從而實現(xiàn)外源基因的表達。根據(jù)此方法構(gòu)建pTRUC表達載體,將紅色熒光蛋白基因mCherry克隆到該表達載體上,轉(zhuǎn)化里氏木霉中并驗證m Cherry的表達�！窘Y(jié)果】陽性轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察到強的紅色熒光信號,在基因組PCR中檢測到mCherry,Westernblotting結(jié)果表明紅色熒光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表達,以上結(jié)果說明該載體構(gòu)建成功,使外源基因mCherry在里氏木霉中正確表達�！窘Y(jié)論】基于URA3基因的快速構(gòu)建表達載體及其構(gòu)建方法切實可行,將成為推動真核表達系統(tǒng)表達異源蛋白的有力工具。 

【文章來源】：微生物學通報. 2020,47(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

RUT-C30基因組DNA提取結(jié)果

將重組載體pTRUC-mCherry轉(zhuǎn)化至RUT-C30中進行表達鑒定，對載體p TRUC的表達功能進行鑒定，挑取菌絲體在激光共聚焦顯微鏡使用587 nm激發(fā)光條件下，可觀察到發(fā)出紅色熒光的菌絲體，而親本菌株在相同條件下沒有觀察到紅色熒光(圖5)，表明載體p TRUC對插入的外源基因可進行有效的轉(zhuǎn)錄，并在RUT-C30中表達出紅色熒光蛋白質(zhì)，說明p TRUC表達載體能實現(xiàn)外源蛋白在RUT-C30中的表達。圖4 p TRUC-mCherry質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

圖3 p TRUC載體及5個DNA片段擴增結(jié)果由于里氏木霉是多細胞的絲狀體，其菌絲體任何一點都能發(fā)生分枝，在菌落發(fā)育的后期，菌絲之間相互接觸，在菌絲接觸點相近的壁局部降解而發(fā)生菌絲的結(jié)網(wǎng)現(xiàn)象，使菌落形成一個完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其意義在于將菌絲用放射狀二維平面擴散到三維網(wǎng)狀，使得營養(yǎng)物質(zhì)等可以運送到菌落的任一地方[24]。重組mCherry里氏木霉菌株的菌絲體同樣也有菌絲融合現(xiàn)象，當菌絲發(fā)生結(jié)網(wǎng)融合時，其表達的m Cherry紅色熒光蛋白也會互相分享，高表達m Cherry紅色熒光的轉(zhuǎn)化子會與低表達的轉(zhuǎn)化子或者是非轉(zhuǎn)化子之間分享細胞質(zhì)中的m Cherry蛋白，從而表現(xiàn)出某一段菌絲表達量很高，其他菌絲表達量較低的情況，這也是絲狀真菌表達較難篩選純高表達菌株的原因之一。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]幾種新型植物基因表達載體的構(gòu)建方法[J]. 張陽璞,楊淑慎.  生物工程學報. 2015(03)
[2]水稻野生種質(zhì)優(yōu)異基因分子標記定位和利用的研究進展[J]. 謝建坤,孔祥禮,包勁松,萬勇.  遺傳. 2004(01)



本文編號：3445442