天冬酰胺內(nèi)切酶（AEPs）可催化短肽形成結(jié)構異常穩(wěn)定的環(huán)肽,其具有藥物設計框架的應用前景.將來源于白花蛇舌草（Oldenlandia affinis）中AEP（Oa AEP1b）環(huán)化酶（cyclase）基因采用融合標簽表達的策略在大腸桿菌菌株BL21中進行誘導表達,并比較了不同的融合標簽麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）,N-utilization substance A（NusA）,小泛素修飾蛋白（SUMO）,綠色熒光蛋白（GFP）以及泛素（ubiquitin）對AEP環(huán)化酶表達量的影響.結(jié)果表明,MBP標簽對AEP的表達促進作用最強,達到（3. 6±0. 05） mg/L,是目前文獻報道的2倍.體外酶切實驗證實該環(huán)化酶可對融合表達的底物蛋白MBP-Kalata B1-6*His-GST進行有效切割,但連接反應過程有待驗證.本研究對AEP環(huán)化酶進行肽工程研究與應用奠定了較好的基礎,并提供了一套高效的研究工具. 

【文章來源】：湖北大學學報(自然科學版). 2020,42(01)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

AEP環(huán)化酶PCR擴增

p ET-28a載體酶切圖

融合標簽可促進目的蛋白的可溶性表達，但在驗證目的蛋白生物活性時，為了避免額外的氨基酸序列對目的蛋白相關特性的影響，往往需要對融合標簽進行去除．本研究中，我們在融合標簽和AEP環(huán)化酶之間加入了HRV 3V蛋白酶的底物識別位點，因此，可以按照1.2.5利用HRV 3V切割MBP-AEP-6*His融合蛋白和SUMO-AEP-6*His融合蛋白中底物序列LEVLFQ/GP來分離融合標簽和AEP環(huán)化酶．反應結(jié)束后將整個切割反應體系用Ni柱進行第二次純化．因AEP環(huán)化酶的C端含有6*His標簽，故可以用來純化AEP環(huán)化酶，從而將融合標簽蛋白和AEP進行有效的分離，得到純AEP環(huán)化酶．將Elution Buffer洗脫下來的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示(圖4),SDS-PAGE中AEP條帶的大小與預測的49.7 kD大小一致，由此分別成功得到了去掉融合標簽MBP和SUMO的純的AEP環(huán)化酶，并根據(jù)Bradford方法測其蛋白質(zhì)濃度，其蛋白濃度為分別為(3.6±0.05)mg/L和(2.8±0.05)mg/L.圖4 移除融合標簽的AEP環(huán)化酶的SDS-PAGE分析


本文編號：3416811