酶是生命體必不可少的重要物質(zhì),為生物體內(nèi)發(fā)生多種催化反應(yīng)提供了重要保障。隨著深入的探究,生物酶在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用越來越重要。周環(huán)反應(yīng)在工業(yè)合成中應(yīng)用廣泛,但能夠催化周環(huán)反應(yīng)的酶很少,目前已報道了黃曲霉中有具有相似活性的酶,對其進行探究將為工業(yè)生產(chǎn)提供重要價值。極端環(huán)境下嗜熱菌的典型生物海棲熱袍菌在合成生物學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛,而對于其乙酰羥酸合酶的研究將為支鏈氨基酸生產(chǎn)提供新的方向。本文開展了對兩種重要酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,首先是黃曲霉生物合成leporinB途徑中生成吡喃環(huán)的關(guān)鍵酶——多功能SAM依賴性酶LepI。我們通過構(gòu)建重組質(zhì)粒并且進行表達純化,得到純度高、均一性好的蛋白后進行結(jié)晶實驗,在篩選了 768個池液條件后,發(fā)現(xiàn)有晶體生長。對相關(guān)的結(jié)晶條件進行優(yōu)化,通過X-射線衍射收集有效的衍射數(shù)據(jù)。在沒有同源結(jié)構(gòu)的情況下,通過對硒代蛋白進行表達純化和結(jié)晶實驗,收集到硒代晶體的衍射數(shù)據(jù)后成功解析LepI的蛋白結(jié)構(gòu)。隨后通過結(jié)構(gòu)分析,序列比對和分子對接實驗提出了LepI的催化機理。本文研究的另一個酶是海棲熱袍菌的乙酰羥酸合酶,乙酰羥酸合酶是生物合成支鏈氨基酸過程中的第一個限速酶,該酶由兩個... 

【文章來源】：北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－］?ＬｅｐｏｒｉｎＢ的部分合成途徑ｔ１６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｐａｒｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?Ｌｅｐｏｒｉｎ?Ｂ［１６］??

適當(dāng)延長時間，有的膠濃度較高電流可能過高可以適當(dāng)??降低電壓。??膠的染脫色：結(jié)束后，拆掉膠板，用考馬斯染色，微波爐加熱２?ｍｉｎ，靜置??一會，重復(fù)２－３次可以使染色效果更好。隨后用脫色液脫色，此過程也可以用??微波爐加熱，與染色過程相同，能從膠上看到條帶時可先初步了解蛋白表達純??化的情況，更換脫色液繼續(xù)脫色，即可得到清晰明了的膠結(jié)果。??ＮＩ?Ｉ?Ｓ?Ｐ?ＢＡＷ?Ｅ?ＢＡＥ?Ｍ??ｍｍｍ??？?１?．?＇??ｍｍ，：??＇?參?：ｆ??ｗ?、?＊?－爲(wèi)’／??圖２－２?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ??如圖２－２所示，對圖中樣品說明：ＮＩ表示誘導(dǎo)前，Ｉ表示誘導(dǎo)后，Ｓ表示破??胞高速離心后的上清，Ｐ表示破胞高速離心后的沉淀，ＢＡＷ表示洗雜結(jié)束后的??Ｂｅａｄｓ，?Ｅ表示洗脫的蛋白，ＢＡＥ表示洗脫完成后的ｂｅａｄｓ。從圖上ＮＩ和Ｉ對比??可以明顯的看到有一條帶在誘導(dǎo)后出現(xiàn)了，在Ｓ中也有，說明目的蛋白成功表達??且是可溶性蛋白；同時在鎳柱上大量掛柱，經(jīng)過洗雜蛋白純度也有所提高，并??且能夠被洗脫下來，雖然ＢＡＥ上有少量蛋白殘留，但是絕大多數(shù)蛋白都被很好??的洗脫了。??２．?３蛋白質(zhì)結(jié)晶實驗??２１??

?＾＾３５?｜：：雜?￣?ＧＳＴ??；響．：暴；．，，??｜。鄭，?ｉ?？?Ｓ??聲??＿９?？?１６?１Ｊ?１８?１９＿２０，??＾?ｎ??????＂仏￣＊■＊＊?Ｃｏｎｄ??Ｆｒａｃｔｉｏｎ??Ａ??．／?—Ｌ?丄?Ｌ?Ｌ?Ｌ?ｋ?Ｌ?ｊ：?ｂ?ｇ?ｋ．Ｌ?ｆｃ?Ｌ，?ｋ?Ｌ?ｈ?Ｕｆ；ｌ?????ｔ?，?＞?＞?＊?ｔ?＜?ｔ?？?？?ｉｏ?ｉｉ?ｕ?ｕ?ｍ?ｉｔ?ｗ?ｉｉ?ｉｅ?ｉｔ?？?２ｉ?ａ??圖３－１?ＬｅｐＩ少量表達純化結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｔｈｅ?ｔｅｓｔ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＬｅｐＩ??ＬｅｐＩ的氨基酸數(shù)為１－３８７分子量約為４３?ＫＤａ，ＧＳＴ標(biāo)簽大小在２６?ＫＤａ。??從帶ＧＳＴ標(biāo)簽的ＬｅｐＩ試表達的蛋白膠圖３－１?ａ上可以明顯的看到誘后樣品Ｉ中??有蛋白被誘導(dǎo)出來，且在后續(xù)的純化過程中洗雜結(jié)束后的親和層析柱上也明顯??富集了這個蛋白，和蛋白Ｍａｒｋｅｒ?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)蛋白在６０－８０?ＫＤａ之間，和帶ＧＳＴ??標(biāo)簽的ＬｅｐＩ基本相符。一般用來做結(jié)晶實驗的蛋白會切掉ＧＳＴ標(biāo)簽，防止標(biāo)??簽過大影響蛋白結(jié)晶。在經(jīng)過ＰＰ酶酶切后跑膠，從膠圖３－ｌｂ上Ｅ和ＢＡＷ對??比可以看到蛋白切掉標(biāo)簽后大小發(fā)生了明顯的變化，在洗脫后的層析柱樣品中??有三個蛋白，從上到下依次是是少量沒有切掉標(biāo)簽的ＬｅｐＩ，ＰＰ酶或者未洗脫完??全的ＬｅｐＩ?（二者分子量相近，在膠圖上不能完全分開），ＧＳＴ標(biāo)簽。將酶切后??３０??


本文編號：3416239