為了快速、高效地篩選到靶標(biāo)核酸適配體,急需通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）建立一種簡便、高效和可視化篩選適配體的新方法。以鏈霉親和素（SA）作為靶標(biāo)模型,利用局域表面等離子體共振（LSPR）和毛細(xì)管電泳（CE）相結(jié)合的方法進(jìn)行篩選和驗證。結(jié)果顯示,在第1輪LSPR-SELEX中,篩選到SA結(jié)合的適配體（SBA）,并且通過LSPR的Trace Drawer數(shù)據(jù)分析軟件計算出SBA的K_D值為107μmol/L;在第2輪LSPR-SELEX中,SBA的K_D值為98 nmol/L。結(jié)果表明,采用LSPR-SELEX技術(shù)經(jīng)2輪篩選,使SBA的親和力提高了1 000倍。隨后,將篩選到的SBA進(jìn)行CE驗證,結(jié)果顯示, SBA適配體與其靶標(biāo)SA具有良好的親和性和特異性。綜上,鑒于LSPR從初始DNA文庫中分離和收集靶標(biāo)適配體的高效性,LSPR-SELEX技術(shù)可用于核酸適配體的篩選。 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020,49(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

LSPR-SELEX技術(shù)篩選核酸適配體

ssDNA初始文庫(L2)長度為114 nt,中間部分為74 nt的隨機(jī)序列,兩端的側(cè)翼為20 nt引物位點(diǎn)。在第1輪LSPR-SELEX(圖2A)中,篩選到與SA結(jié)合的適配體SBA(命名為SBA-1),其KD值為107 μmol/L (表2)。在第2輪LSPR-SELEX(圖2B)中,SBA(命名為SBA-2)的KD值為98 nmol/L(表2)。LSPR-SELEX的結(jié)果表明,LSPR-SELEX技術(shù)在2輪的篩選中使SBA的親和力提高了1 000倍,獲得納摩爾范圍內(nèi)的適配體,將篩選到與SA結(jié)合的適配體命名為SBA。表2 SBA與SA相互作用的動力學(xué)參數(shù)Tab.2 The kinetic parameters of SBA-SA interaction SBA序號SBA No. 結(jié)合速率常數(shù)ka 解離速率常數(shù)kd 平衡解離速率常數(shù)/(mol/L)KD SBA-1 2.76×102 2.96×10-2 1.07×10-4 SBA-2 6.70×103 6.57×10-4 9.80×10-8

將第2輪收集到的核酸庫產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞、測序等獲得了鏈霉親和素的核酸適配體SBA序列。由圖4可知,SBA適配體的總長度為114 nt,其三維結(jié)構(gòu)為莖環(huán)狀。圖4 SBA適配體的序列

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]SELEX技術(shù)進(jìn)展[J]. Sanad Abdalbage Mohammed Abdalsadeg,王鳴剛,袁紅霞,汪靖,王進(jìn),廖世奇.  甘肅醫(yī)藥. 2017(11)



本文編號：3402592