[目的]旨在研究PRMT5沉默與TSA處理抑制組蛋白去乙酰化酶（HDAC）的活性對(duì)人肝癌Hep G2細(xì)胞中Klf4基因表達(dá)的影響。[方法]采取siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的方法沉默PRMT5,TSA處理抑制HDAC,通過RT-PCR、luciferase assay、Western Blotting檢測PRMT5沉默和TSA處理對(duì)Klf4表達(dá)的影響。[結(jié)果]在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染的三組PRMT5 siRNA均能有效干擾PRMT5的表達(dá),其中si PRMT5-1對(duì)于PRMT5 mRNA和蛋白的干擾效果最好。TSA處理細(xì)胞后,組蛋白乙�；揎桯3K9ac增加,HDAC3 mRNA和PRMT5 mRNA表達(dá)下降,PRMT5和HDAC1蛋白表達(dá)下降。RT-PCR、luciferase assay、Western Blotting結(jié)果顯示單獨(dú)沉默PRMT5或用TSA處理細(xì)胞,Klf4的轉(zhuǎn)錄被激活,而沉默PRMT5的同時(shí)用TSA處理細(xì)胞對(duì)Klf4轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用更為明顯。[結(jié)論]PRMT5沉默或TSA處理都能促進(jìn)Klf4的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)沉默PRMT5和用TSA處理對(duì)Klf4的轉(zhuǎn)錄激活更強(qiáng)烈,說明PRMT... 

【文章來源】：生物技術(shù). 2020,30(06)

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RT-PCR檢測siRNA沉默對(duì)PRMT5 mRNA表達(dá)的影響

在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si Ctrl、si PRMT5-1、si PRMT5-2和si PRMT5-3，未轉(zhuǎn)染的作為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染72h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，Western Blotting檢測"-Actin和PRMT5蛋白的水平，其中"-Actin作為內(nèi)參。如圖2顯示，轉(zhuǎn)染si PRMT5-1、si PRMT5-2和si PRMT5-3組中，PRMT5蛋白水平都下降，其中轉(zhuǎn)染si PRMT5-1的細(xì)胞中PRMT5蛋白水平下降最明顯。因而，后續(xù)開展的實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)染si PRMT5-1的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)PRMT5的基因沉默。2.3 RT-PCR檢測TSA處理對(duì)基因表達(dá)的影響

用400 nmol/L的TSA處理HepG2細(xì)胞從而來抑制細(xì)胞內(nèi)組蛋白去乙�；傅幕钚�，DMSO處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，處理24h后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。利用RT-PCR檢測PRMT5和HDAC3的mRNA表達(dá)。如圖3所示，與對(duì)照組相比，TSA處理后PRMT5和HDAC3 mRNA的水平下降。2.4 Western Blotting檢測TSA處理對(duì)組蛋白乙�；揎椧约暗鞍妆磉_(dá)的影響

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]非洲爪蛙prmt5.L基因的克隆及時(shí)空表達(dá)譜分析[J]. 曹青,劉浩,沈滟,劉晨.  生物技術(shù). 2020(01)
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本文編號(hào)：3378548