溫度誘導(dǎo)Targetron系統(tǒng)用于大腸桿菌高效基因失活
發(fā)布時(shí)間：2021-08-10 05:01
構(gòu)建基于Te I3c/4c嗜熱二型內(nèi)含子的溫度誘導(dǎo)Targetron基因失活系統(tǒng)（Thermotargetron）,并應(yīng)用于中溫微生物基因編輯。在大腸桿菌HMS174（DE3）基因組中,選擇Subunitofflagellum基因（fliC）和C4dicarboxylate orotate:H+symporter基因（dctA）為靶基因。根據(jù)Te I3c/4c DNA識(shí)別規(guī)則,在fliC和dctA基因中選擇fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位點(diǎn)為基因打靶位點(diǎn)。使用重疊延伸PCR方法,基于pHK-TT1A質(zhì)粒構(gòu)建打靶載體。打靶載體轉(zhuǎn)化HMS174菌株,對數(shù)期轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液48℃熱激1h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA測序檢測突變株并計(jì)算基因失活效率。獲得突變株后,通過瓊脂穿刺和碳源代謝實(shí)驗(yàn),鑒定ΔfliC、ΔdctA突變株表型變化。菌落PCR測序結(jié)果表明,Te I3c/4c插入到fliC和dctA基因設(shè)計(jì)位點(diǎn),且打靶效率高達(dá)100%。突變株表型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,ΔfliC突變株運(yùn)動(dòng)能力顯著下降,ΔdctA突變株蘋果酸代謝能力缺失。綜上所述,...
【文章來源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020,36(08)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：13 頁
【部分圖文】：
圖4 兩輪PCR突變TeI3c/4c靶序列識(shí)別位點(diǎn)
值得注意的是Thermotargetron核心元件TeI3c/4c二型內(nèi)含子只在高溫時(shí)(48–60℃)具有“歸巢”活性。因此，Thermotargetron具有2個(gè)特征：(1)適用于嗜熱微生物基因失活[14];(2)在可耐高溫的中溫微生物中，具有溫度誘導(dǎo)特征。溫度誘導(dǎo)屬于物理誘導(dǎo)，相比ClosTron系統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)，具有易實(shí)現(xiàn)(無需從頭構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng))、更精確(精確控制保溫時(shí)間)和更直接(直接控制TeI3c/4c活性)等優(yōu)點(diǎn)。除此之外Thermotargetron系統(tǒng)識(shí)別序列為“AAnnnnnnnnnnnnn A”，對于GC含量比較低的中溫微生物具有更多的靶點(diǎn)可供選擇，即其更適合低GC含量微生物的基因打靶。本研究利用來源于熱纖梭菌groEL啟動(dòng)子表達(dá)Thermotargetron核心元件TeI3c/4c二型內(nèi)含子，以HMS174(DE3)為可耐高溫的中溫微生物模型，并以其fliC和dctA基因?yàn)榘谢�，�?yàn)證溫度誘導(dǎo)型Thermotargetron基因失活系統(tǒng)的可行性，為中溫微生物的基因編輯提供新的工具。1 材料與方法
HMS174 fliC基因(ECHMS174＿01916)和dctA基因(ECHMS174＿03796)全長分別為1 497 bp和1 287 bp(圖2A)。在fliC基因中選擇位點(diǎn)符合TeI3c/4c識(shí)別規(guī)律的fliC489a(5′-AA gagttttagcatcA-3′)、fliC828s(5′-AAtactactaaagct A-3′)和fliC1038s(5′-AAaactattacctatA-3′)位點(diǎn)。在dctA基因中選擇dctA2a(5′-AAcagagaggttttc A-3′)位點(diǎn)。使用PCR突變野生型TeI3c/4c IBS1、IBS2、EBS1和EBS2位點(diǎn)，構(gòu)建針對fliC489a、828s、1038s和dctA2a四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒pHK-TT1A-fliC489a、pHK-TT1A-fliC828s、pHK-TT1A-fliC1038s和pHK-TT1A-dctA2a(圖2B)。2.2 Thermotargetron打靶質(zhì)粒構(gòu)建
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大腸桿菌中dctA基因敲除及其蘋果酸攝取功能鑒定[J]. 姜巨全,張正來,徐桐,孟琳. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(05)
[2]大腸桿菌FliC基因敲除后對大腸桿菌生物膜形成的影響[J]. 喻華英,馬燕. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(08)
本文編號(hào)：3333513
【文章來源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020,36(08)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：13 頁
【部分圖文】：
圖4 兩輪PCR突變TeI3c/4c靶序列識(shí)別位點(diǎn)
值得注意的是Thermotargetron核心元件TeI3c/4c二型內(nèi)含子只在高溫時(shí)(48–60℃)具有“歸巢”活性。因此，Thermotargetron具有2個(gè)特征：(1)適用于嗜熱微生物基因失活[14];(2)在可耐高溫的中溫微生物中，具有溫度誘導(dǎo)特征。溫度誘導(dǎo)屬于物理誘導(dǎo)，相比ClosTron系統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)，具有易實(shí)現(xiàn)(無需從頭構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng))、更精確(精確控制保溫時(shí)間)和更直接(直接控制TeI3c/4c活性)等優(yōu)點(diǎn)。除此之外Thermotargetron系統(tǒng)識(shí)別序列為“AAnnnnnnnnnnnnn A”，對于GC含量比較低的中溫微生物具有更多的靶點(diǎn)可供選擇，即其更適合低GC含量微生物的基因打靶。本研究利用來源于熱纖梭菌groEL啟動(dòng)子表達(dá)Thermotargetron核心元件TeI3c/4c二型內(nèi)含子，以HMS174(DE3)為可耐高溫的中溫微生物模型，并以其fliC和dctA基因?yàn)榘谢�，�?yàn)證溫度誘導(dǎo)型Thermotargetron基因失活系統(tǒng)的可行性，為中溫微生物的基因編輯提供新的工具。1 材料與方法
HMS174 fliC基因(ECHMS174＿01916)和dctA基因(ECHMS174＿03796)全長分別為1 497 bp和1 287 bp(圖2A)。在fliC基因中選擇位點(diǎn)符合TeI3c/4c識(shí)別規(guī)律的fliC489a(5′-AA gagttttagcatcA-3′)、fliC828s(5′-AAtactactaaagct A-3′)和fliC1038s(5′-AAaactattacctatA-3′)位點(diǎn)。在dctA基因中選擇dctA2a(5′-AAcagagaggttttc A-3′)位點(diǎn)。使用PCR突變野生型TeI3c/4c IBS1、IBS2、EBS1和EBS2位點(diǎn)，構(gòu)建針對fliC489a、828s、1038s和dctA2a四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒pHK-TT1A-fliC489a、pHK-TT1A-fliC828s、pHK-TT1A-fliC1038s和pHK-TT1A-dctA2a(圖2B)。2.2 Thermotargetron打靶質(zhì)粒構(gòu)建
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大腸桿菌中dctA基因敲除及其蘋果酸攝取功能鑒定[J]. 姜巨全,張正來,徐桐,孟琳. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(05)
[2]大腸桿菌FliC基因敲除后對大腸桿菌生物膜形成的影響[J]. 喻華英,馬燕. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(08)
本文編號(hào)：3333513
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