目的通過(guò)在成纖維細(xì)胞NIH3T3中內(nèi)源性過(guò)表達(dá)巢蛋白（Nestin）,研究其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）作用下細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)與MAPK相關(guān)通路的影響。方法通過(guò)CRISPR/SAM技術(shù)構(gòu)建內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin的細(xì)胞株,用MTS實(shí)驗(yàn)、Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,經(jīng)qPCR、Western blot與免疫熒光染色明確TGF-β1對(duì)其膠原蛋白與MAPK通路的影響。結(jié)果 CRISPR/SAM技術(shù)能使內(nèi)源性Nestin表達(dá)顯著提高（P<0.05）,而內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin對(duì)NIH3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移有明顯促進(jìn)作用（P<0.05）,對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的膠原蛋白表達(dá)及MAPK的激活也有明顯的抑制效應(yīng)（P<0.01）。結(jié)論用CRISPR/SAM技術(shù)內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin可以明顯促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移,但卻抑制TGF-β1誘導(dǎo)下膠原蛋白的表達(dá)及MAPK的激活。 

【文章來(lái)源】：第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,42(02)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin LV-sgRNA-MS2-P65-HSF1-Neo質(zhì)粒構(gòu)測(cè)序

qPCR檢測(cè)所構(gòu)建細(xì)胞的Nestin的表達(dá)水平,解鏈曲線(圖2A)證實(shí)反應(yīng)特異性高,qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Nes-sgRNA #1、#2、#3和對(duì)照組con的mRNA相對(duì)表達(dá)水平為(20.30±6.025)、(1.858±0.634)、(29.20±4.201)、(1.033±0.152),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中#1和#3表達(dá)量最高(與對(duì)照組con相比,P<0.01)(圖2B)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,Nes-sgRNA #1、#2、#3、對(duì)照組con的蛋白相對(duì)表達(dá)水平為(0.540±0.045)、(0.036±0.008)、(0.469±0.030)、(0.024±0.008),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2C、D)。與qPCR結(jié)果相似,Nes-sgRNA#1和#3細(xì)胞Nestin相對(duì)表達(dá)量最高(與對(duì)照組con相比,P<0.01),后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇#1和#3細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行。免疫熒光IF驗(yàn)證了Nes-sgRNA #1和#3調(diào)控Nestin的表達(dá)模式,結(jié)果顯示細(xì)胞模型中Nestin的表達(dá)模式與對(duì)照一致,Nestin蛋白在細(xì)胞質(zhì)表達(dá),形成輕微彎曲的纖維,以放射狀形式從核周發(fā)散出去。免疫熒光也證實(shí),與對(duì)照相比Nes-sgRNA#1和#3細(xì)胞中Nestin表達(dá)更多(圖2E)。2.2 內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin后成纖維細(xì)胞的側(cè)向遷移能力,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)內(nèi)源性Nestin后成纖維細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng),結(jié)果表明,12 h的時(shí)候,#1和#3組細(xì)胞中內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin后,遷移能力更好 (P<0.01,圖4)。圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)NIH3T3細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)表達(dá)Nestin后對(duì)遷移的影響


本文編號(hào)：3332945