目的通過在成纖維細胞NIH3T3中內(nèi)源性過表達巢蛋白（Nestin）,研究其對細胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）作用下細胞膠原蛋白表達與MAPK相關(guān)通路的影響。方法通過CRISPR/SAM技術(shù)構(gòu)建內(nèi)源性過表達Nestin的細胞株,用MTS實驗、Western blot檢測細胞增殖能力,細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力,經(jīng)qPCR、Western blot與免疫熒光染色明確TGF-β1對其膠原蛋白與MAPK通路的影響。結(jié)果 CRISPR/SAM技術(shù)能使內(nèi)源性Nestin表達顯著提高（P<0.05）,而內(nèi)源性過表達Nestin對NIH3T3細胞的生長、遷移有明顯促進作用（P<0.05）,對TGF-β1誘導(dǎo)的膠原蛋白表達及MAPK的激活也有明顯的抑制效應(yīng)（P<0.01）。結(jié)論用CRISPR/SAM技術(shù)內(nèi)源性過表達Nestin可以明顯促進NIH3T3細胞的生長和遷移,但卻抑制TGF-β1誘導(dǎo)下膠原蛋白的表達及MAPK的激活。 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報. 2020,42(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

內(nèi)源性過表達Nestin LV-sgRNA-MS2-P65-HSF1-Neo質(zhì)粒構(gòu)測序

qPCR檢測所構(gòu)建細胞的Nestin的表達水平,解鏈曲線(圖2A)證實反應(yīng)特異性高,qPCR檢測結(jié)果顯示,Nes-sgRNA #1、#2、#3和對照組con的mRNA相對表達水平為(20.30±6.025)、(1.858±0.634)、(29.20±4.201)、(1.033±0.152),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中#1和#3表達量最高(與對照組con相比,P<0.01)(圖2B)。Western blot檢測結(jié)果顯示,Nes-sgRNA #1、#2、#3、對照組con的蛋白相對表達水平為(0.540±0.045)、(0.036±0.008)、(0.469±0.030)、(0.024±0.008),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2C、D)。與qPCR結(jié)果相似,Nes-sgRNA#1和#3細胞Nestin相對表達量最高(與對照組con相比,P<0.01),后續(xù)實驗選擇#1和#3細胞繼續(xù)進行。免疫熒光IF驗證了Nes-sgRNA #1和#3調(diào)控Nestin的表達模式,結(jié)果顯示細胞模型中Nestin的表達模式與對照一致,Nestin蛋白在細胞質(zhì)表達,形成輕微彎曲的纖維,以放射狀形式從核周發(fā)散出去。免疫熒光也證實,與對照相比Nes-sgRNA#1和#3細胞中Nestin表達更多(圖2E)。2.2 內(nèi)源性過表達Nestin對NIH3T3細胞增殖的影響

細胞劃痕實驗檢測內(nèi)源性過表達Nestin后成纖維細胞的側(cè)向遷移能力,結(jié)果顯示,與對照組相比,過表達內(nèi)源性Nestin后成纖維細胞的遷移能力明顯增強,結(jié)果表明,12 h的時候,#1和#3組細胞中內(nèi)源性過表達Nestin后,遷移能力更好 (P<0.01,圖4)。圖4 劃痕實驗檢驗NIH3T3細胞內(nèi)源性過表達Nestin后對遷移的影響


本文編號：3332945