本研究參照GenBank中編碼禽源熱休克蛋白HSP70、HSP40和核糖體蛋白R(shí)L4等的基因序列,分別設(shè)計(jì)特異性引物,采用RT-PCR擴(kuò)增HSP70、HSP40和RPL4基因,經(jīng)雙酶切后克隆到真核表達(dá)載體pEF1α-Myc,得到重組質(zhì)粒pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40和pEF1α-Myc-RPL4;將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,采用間接免疫熒光和Western-blot技術(shù),對(duì)目的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,Myc-HSP70、Myc-HSP40和Myc-RPL4融合蛋白在HEK293T細(xì)胞內(nèi)得到了正確表達(dá)。本研究為后續(xù)禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國動(dòng)物檢疫. 2020,37(03)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

真核表達(dá)重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果

如圖3所示，在熒光顯微鏡下，真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40、pEF1α-Myc-RPL4轉(zhuǎn)染組的HEK293T細(xì)胞均可觀察到綠色熒光，而分別以鼠源Myc標(biāo)簽抗體為一抗的陰性對(duì)照組則無綠色熒光出現(xiàn)。2.4 Western-blot檢測目的蛋白的表達(dá)

HSP70蛋白是一類非常保守的蛋白質(zhì)，也是在HSPS家族中最重要的蛋白質(zhì)之一。HSP70蛋白主要作為分子伴侶參與病毒的入侵過程[10]，可以穩(wěn)定蛋白前體的構(gòu)象，并保證蛋白質(zhì)合成過程中的正確折疊。目前已有很多研究證明了HSP70蛋白可以與多種病毒蛋白發(fā)生相互作用，從而影響其入侵過程。例如：豬源HSP70蛋白被證明可與豬瘟病毒NS5A蛋白發(fā)生相互作用[4]；蚊子體內(nèi)的HSP70蛋白可以與乙型腦炎病毒復(fù)制復(fù)合體相互作用，并參與該病毒的內(nèi)吞過程[11-12]；鼠源HSP70蛋白還可以與乙型腦炎病毒E蛋白相互作用，而人源HSP70蛋白可以與登革熱病毒蛋白等發(fā)生相互作用[5]。HSP40蛋白也是HSPS家族中重要的成員之一，其功能與HSP70蛋白具有一定關(guān)聯(lián)，可協(xié)助HSP70蛋白更好地發(fā)揮其生物功能，同時(shí)該蛋白還具有修復(fù)變性蛋白質(zhì)的功能[13]。本研究所選用的DNAJB6蛋白是禽源HSP40蛋白的一種，同樣是一種具有分子伴侶功能的蛋白質(zhì)。關(guān)于HSP40蛋白與病毒蛋白發(fā)生相互作用的研究也取得了一些進(jìn)展，如：人源HSP40蛋白被證明可以與黃熱病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS4A相互作用，從而促進(jìn)病毒復(fù)制復(fù)合體的形成[14]；豬源HSP40蛋白還可以與豬圓環(huán)病毒的Cap蛋白相互作用[15];HSP70、HSP90、HSP40蛋白三者可以和免疫親和素蛋白構(gòu)成復(fù)合體，并與微管結(jié)合進(jìn)入核轉(zhuǎn)運(yùn)過程[16]�？偠灾琀SP70蛋白和HSP40蛋白均在病毒侵染過程中扮演著重要角色。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]熱休克蛋白40、70、105β在三氧化二砷誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞系bel-7402凋亡中的作用[J]. 張宇陽,姜洪池,方?jīng)_,閆呈慧,付松濱.  中華肝膽外科雜志. 2004(07)

博士論文
[1]豬瘟病毒NS5A蛋白與HSP70的相互作用及引起細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)[D]. 張成成.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015

碩士論文
[1]與IBDV VP2、VP3相互作用宿主細(xì)胞蛋白的篩選及鑒定[D]. 陳玉明.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014



本文編號(hào)：3319454