目的:研究酵母細(xì)胞中Whi2蛋白對自噬的調(diào)控機(jī)制。方法:通過同源重組法構(gòu)建基因缺陷型酵母菌株,通過轉(zhuǎn)入特定質(zhì)粒過表達(dá)相關(guān)蛋白。利用prATG8-GFP質(zhì)粒檢測特定營養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)自噬基因ATG8的轉(zhuǎn)錄水平,并通過蛋白免疫印跡顯示GFP的表達(dá)量間接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)自噬誘導(dǎo)的水平。利用prATG8-GFP-ATG8質(zhì)粒檢測低濃度亮氨酸條件下細(xì)胞內(nèi)自噬流水平,游離GFP占GFP表達(dá)總量（游離GFP與GFP-Atg8融合蛋白的總和）的比值即可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)自噬流的水平。并根據(jù)基因上位性分析法對結(jié)果進(jìn)行分析,構(gòu)建信號通路。結(jié)果:通過prATG8-GFP-ATG8質(zhì)粒檢測細(xì)胞內(nèi)自噬流水平發(fā)現(xiàn),無論是低濃度亮氨酸條件下還是無氮源的條件下,△whi2中GFP-Atg8的表達(dá)量都明顯比WT中少。分別在WT和△whi2中敲除PEP4抑制自噬小體的降解過程,△whi2△pep4與△pep4相比,細(xì)胞內(nèi)GFP-Atg8的表達(dá)量也明顯降低。同時(shí),通過prATG8-GFP質(zhì)粒檢測到Awhi2 WT中ATG8轉(zhuǎn)錄水平低,△whi2△pep4中ATG8轉(zhuǎn)錄水平比△pep4低。PKA對自噬誘導(dǎo)和自噬流水平有抑制作用,在△whi2... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．?Ｗｈｉ２、ＴＯＲＣｌ與自噬的關(guān)系（Ａ）在低濃度亮氨酸條件下，Ｗｈｉ２通過抑制Ｔ０ＲＣ１??激活自噬流，并通過獨(dú)立于Ｔ０ＲＣ１的機(jī)制誘導(dǎo)自噬

前言?Ｗｈｉ２調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞自噬的機(jī)制研究??Ｒａｓ２?ｇｌｕｃｏｓｅ??ｉ??ＡＣ?ｖ??ｆ?今〉ｃＡＭＰ?Ｉ??Ｐｄｅ２??ＡＴＰ?〇〇??廣〇??＇?ｉｎａｃｔｉｖｅ??Ｂｃｙ１?Ｔｐｋ１－３??ａｃｔｉｖｅ??Ｂｃｙ１?Ｔｐｋ１－３??１?Ｒｉｍ１５??Ｐ．??Ａｔｇ１３?＾?Ｍｓｎ２?Ｍｓｎ４?Ｉ?Ｕｍｅ６??〇－??Ａｕｔｏｐｈａｇｙ?ｆｌｕｘ?ＡＴＧ８?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??圖２．?ＰＫＡ信號通路及其對自噬的調(diào)控機(jī)制??４．酵母Ｗｈｉ２蛋白及其人類同源蛋白ＫＣＴＤ１１??早在１９８０年，科學(xué)家在篩選調(diào)控細(xì)胞周期的基因時(shí)就鑒別出了酵母細(xì)胞中的??ｆＴ／／／２［２２］。在營養(yǎng)匱乏的條件下，野生型Ｗｈｉ２可以阻止細(xì)胞進(jìn)入下一生長周期。在??基因突變體中，細(xì)胞周期蛋白Ｇｌｎｌ及Ｇｌｎ２的轉(zhuǎn)錄受到阻礙［２３，２４］，因此，即使??在營養(yǎng)匱乏的條件下，灰Ｈ７２基因突變的菌株仍然不能停止分裂［２５＿２７］。，同時(shí)，ＰＦ／／／２??的缺失會引起復(fù)制周期的縮短，異常激活Ｒａｓ－ｃＡＭＰ－ＰＫＡ通路，導(dǎo)致細(xì)胞在分裂過??程中發(fā)生肌動蛋白聚集、線粒體功能障礙、活性氧的積累、細(xì)胞活力下降以及肌動蛋??白骨架紊亂現(xiàn)象［２８，２９］。??已知Ｗｈｉ２蛋白在一般應(yīng)激反應(yīng)途徑中起作用，Ｗｈｉ２與Ｐｓｒｌｐ和Ｐｓｒ２ｐ發(fā)生物理??相互作用，且依賴Ｐｓｒｌ／Ｐｓｒ２對環(huán)境壓力做出反饋［３ｅ］。同時(shí)，Ｗｈｉ２也依賴Ｐｓｒｌ、Ｐｓｒ２??參與自嗤的調(diào)控。如前所述，在低濃度亮氨酸條件下，Ｗｈｉ２依賴Ｐｓｒｌ／Ｐｓｒ２且獨(dú)立于??ＳＥＡＣＩＴ－Ｇｔｒ通路抑制Ｔ０ＲＣ１活性從而激活自噬流，并且通過獨(dú)立于Ｔ０ＲＣ１的機(jī)制?

＞?ｎ．ｓ－－丨?Ｄ?，?＊?＊?Ｗｈ??Ｓ８Ｗ＇?ｉ內(nèi)?＿?呈?ｌ５＿?…?Ｄ５ｈ??２?６０＾?■?ｒｆｉ?Ｉ?Ｉ?ｔ?１?ｒｆｉ??２?ｓ；?＆?１０?？?Ｉ?１?＾?Ｎ?Ｔ??４０％?■?Ｉ?．?７?Ｔ?ｒｉ－｜?Ｉ?ｒｈ?｜?Ｏ?丨?＊＊＊?｜?園??ｒｉｉｕｕｕ?ｏｉｏ?ｕｕｕ?ｗｉｗ?１?ｌ〇ｑ?ｊｏ??ＷＴ?＾ｗｈｉ２?ＷＴ?＼ｗｈｉ２?ＷＴ?＼ｗｈｉ２?ＷＴ?＼ｗｈｉ２??１０％?Ｌｅｕ?ＹＮＢ?１０％Ｌｅｕ?ＹＮＢ??圖３．?Ａｗ／ｉ／２比ＷＴ中自噬流水平低（Ａ）分別向ＷＴ和Ａｗ／ｚ／２中轉(zhuǎn)入??質(zhì)粒，檢測低濃度亮氨酸（ＣＳＨ－ＵＲＡ１０％Ｌｅｕ）和去除氮源（ＹＮＢ）的條件下菌株中??自噻通量的水平。（Ｂ）統(tǒng)計(jì)在低濃度亮氨酸條件下和減去氮源的條件下，ＷＴ和ＡｗＡ／２??中游離ＧＦＰ的量占ＧＦＰ表達(dá)總量（游離ＧＦＰ和ＧＦＰ－Ａｔｇ８融合蛋白的總和）的比值，??ｎ＝３。（Ｃ）以Ｐｇｋｌ蛋白為內(nèi)參，以ＷＴ中Ｏｈ時(shí)ＧＦＰ的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值，分別對低??濃度亮氨酸條件和去除氮源的條件下ＷＴ、ＡｗＡ／２中游離ＧＦＰ的水平進(jìn)行定量，ｎ＝３。??定量結(jié)果均通過雙尾ｔ檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)方差；＊Ｐ＜０．０５，??＊＊０．０１＜Ｐ＜０．０２，?＊＊＊Ｐ＜０．０１具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ｎ．ｓ．，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。??然而，無論在低濃度亮氨酸條件下還是去除氮源的條件下，Ａｗ／ｎ＿２中游離ＧＦＰ??的水平均低于ＷＴ中游離ＧＦＰ的水平（圖３Ａ，?１Ｃ）。那么，與ＷＴ相比，究竟是ｚＷＡ／２??中乂ＴＯＳ本身的誘導(dǎo)水平比低還是因?yàn)榈鞍捉到馑俣缺容^快導(dǎo)致細(xì)胞中Ａｔｇ８的水平??比較低？為了進(jìn)


本文編號：3319005