目的:檢測細(xì)胞形態(tài)、大小、粘附性的改變,對不同細(xì)胞亞型的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序,富集分析差異表達(dá)基因的功能,并分析OCT4下游靶基因的表達(dá)及功能,揭示人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞（human hair follicle mesenchymal stem cell,hHFMSC）中形態(tài)與粘附、多潛能性和造血之間的關(guān)聯(lián),闡明OCT4重編程的hHFMSC中紅細(xì)胞生成的可能分子機(jī)制,為體外生成紅細(xì)胞的研究提供新的思路。方法:①在細(xì)胞培養(yǎng)過程中收集含有懸浮細(xì)胞的上層培養(yǎng)液并離心,以分離貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞,于相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。②利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞前向散射,比較細(xì)胞的相對大小;通過細(xì)胞分離實驗和細(xì)胞粘附實驗分別檢測細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附力的相對大小。③用RNA測序技術(shù)分析各組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的差異并篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene,DEG）,同時結(jié)合文獻(xiàn)篩查OCT4下游靶基因的表達(dá)情況。④通過GO功能富集及KEGG信號通路富集計算,分析DEG的生物功能,并根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋TJ信號通路中的DEG。⑤qPCR和Western blot驗證TJ通... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后hHFMSC的形態(tài)變化

實驗結(jié)果151.2細(xì)胞體積檢測當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%-80%，分別收集hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測FSC，用于比較細(xì)胞相對大校數(shù)據(jù)顯示（圖1.2），hHFMSCOCT4-adherent的體積明顯小于hHFMSC，而hHFMSCOCT4-floating相較于hHFMSCOCT4-adherent體積更小，與鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)改變一致。表明OCT4過表達(dá)使細(xì)胞大小發(fā)生變化。圖1.2OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后hHFMSC的體積變化流式細(xì)胞術(shù)檢測FSC，比較細(xì)胞的相對體積大校（**，P0.01；***，P0.001）1.3細(xì)胞粘附性檢測利用細(xì)胞分離實驗和細(xì)胞粘附實驗，檢測各組細(xì)胞的粘附性差異（圖1.3）。細(xì)胞分離實驗中，hHFMSCOCT4-adherent的單細(xì)胞百分比為47.5%，高于hHFMSC（9.4%），而hHFMSCOCT4-floating的單細(xì)胞百分比為85%，明顯高于hHFMSCOCT4-adherent與hHFMSC。在細(xì)胞粘附實驗中，hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating在培養(yǎng)板底面上貼附的細(xì)胞百分比分別為70.9%、18.4%和2.3%，說明hHFMSCOCT4-floating與基質(zhì)的貼附率顯著低于hHFMSC及hHFMSCOCT4-adherent。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4后細(xì)胞粘附性顯著降低，并且與貼壁細(xì)胞相比，懸浮細(xì)胞的粘附性更低。

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文16圖1.3OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后hHFMSC的粘附性變化細(xì)胞分離實驗與細(xì)胞粘附實驗分別檢測細(xì)胞-細(xì)胞粘附性、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附性。（*，P0.05；**，P0.01；***，P0.001；****，P0.0001）綜上，轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4使hHFMSC形態(tài)、大小及粘附性均發(fā)生顯著變化，并以hHFMSCOCT4-floating的形態(tài)最接近圓形，體積相對最小，粘附性最低，證明單因子OCT4可能對hHFMSC的基因組進(jìn)行了重編程，并改變細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長方式。2.轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4改變hHFMSC的基因轉(zhuǎn)錄本2.1主成分分析為了探索OCT4如何影響hHFMSC的細(xì)胞形態(tài)及粘附性，以及這種改變是否在體外誘導(dǎo)hHFMSCOCT4生成紅細(xì)胞過程中發(fā)揮作用，我們提取三組細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。首先，為驗證各組內(nèi)樣本的相似度及組間樣本的差異性，進(jìn)行PCA分析，如PCA的二維分布圖（圖2.1A）及三維分布圖所示（圖2.1B），各組內(nèi)三個細(xì)胞樣本的距離相對較近，形成相對獨(dú)立的群集，表明各組細(xì)胞樣本具有良好的重復(fù)性；另一方面，各組樣本之間的距離相對較遠(yuǎn)，表明其基因轉(zhuǎn)錄


本文編號：3318947