目的:檢測細胞形態(tài)、大小、粘附性的改變,對不同細胞亞型的轉錄組進行測序,富集分析差異表達基因的功能,并分析OCT4下游靶基因的表達及功能,揭示人毛囊間充質干細胞（human hair follicle mesenchymal stem cell,hHFMSC）中形態(tài)與粘附、多潛能性和造血之間的關聯,闡明OCT4重編程的hHFMSC中紅細胞生成的可能分子機制,為體外生成紅細胞的研究提供新的思路。方法:①在細胞培養(yǎng)過程中收集含有懸浮細胞的上層培養(yǎng)液并離心,以分離貼壁細胞與懸浮細胞,于相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。②利用流式細胞術檢測細胞前向散射,比較細胞的相對大小;通過細胞分離實驗和細胞粘附實驗分別檢測細胞-細胞、細胞-細胞外基質粘附力的相對大小。③用RNA測序技術分析各組細胞轉錄本的差異并篩選差異表達基因（differentially expressed gene,DEG）,同時結合文獻篩查OCT4下游靶基因的表達情況。④通過GO功能富集及KEGG信號通路富集計算,分析DEG的生物功能,并根據KEGG數據庫注釋TJ信號通路中的DEG。⑤qPCR和Western blot驗證TJ通... 

【文章來源】：青島大學山東省

【文章頁數】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

OCT4轉導后hHFMSC的形態(tài)變化

實驗結果151.2細胞體積檢測當細胞融合達70%-80%，分別收集hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating，利用流式細胞術檢測FSC，用于比較細胞相對大校數據顯示（圖1.2），hHFMSCOCT4-adherent的體積明顯小于hHFMSC，而hHFMSCOCT4-floating相較于hHFMSCOCT4-adherent體積更小，與鏡下觀察到的細胞形態(tài)改變一致。表明OCT4過表達使細胞大小發(fā)生變化。圖1.2OCT4轉導后hHFMSC的體積變化流式細胞術檢測FSC，比較細胞的相對體積大校（**，P0.01；***，P0.001）1.3細胞粘附性檢測利用細胞分離實驗和細胞粘附實驗，檢測各組細胞的粘附性差異（圖1.3）。細胞分離實驗中，hHFMSCOCT4-adherent的單細胞百分比為47.5%，高于hHFMSC（9.4%），而hHFMSCOCT4-floating的單細胞百分比為85%，明顯高于hHFMSCOCT4-adherent與hHFMSC。在細胞粘附實驗中，hHFMSC、hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating在培養(yǎng)板底面上貼附的細胞百分比分別為70.9%、18.4%和2.3%，說明hHFMSCOCT4-floating與基質的貼附率顯著低于hHFMSC及hHFMSCOCT4-adherent。以上結果表明，轉導OCT4后細胞粘附性顯著降低，并且與貼壁細胞相比，懸浮細胞的粘附性更低。

青島大學碩士學位論文16圖1.3OCT4轉導后hHFMSC的粘附性變化細胞分離實驗與細胞粘附實驗分別檢測細胞-細胞粘附性、細胞-細胞外基質粘附性。（*，P0.05；**，P0.01；***，P0.001；****，P0.0001）綜上，轉導OCT4使hHFMSC形態(tài)、大小及粘附性均發(fā)生顯著變化，并以hHFMSCOCT4-floating的形態(tài)最接近圓形，體積相對最小，粘附性最低，證明單因子OCT4可能對hHFMSC的基因組進行了重編程，并改變細胞形態(tài)學及生長方式。2.轉導OCT4改變hHFMSC的基因轉錄本2.1主成分分析為了探索OCT4如何影響hHFMSC的細胞形態(tài)及粘附性，以及這種改變是否在體外誘導hHFMSCOCT4生成紅細胞過程中發(fā)揮作用，我們提取三組細胞的總RNA并進行轉錄組測序。首先，為驗證各組內樣本的相似度及組間樣本的差異性，進行PCA分析，如PCA的二維分布圖（圖2.1A）及三維分布圖所示（圖2.1B），各組內三個細胞樣本的距離相對較近，形成相對獨立的群集，表明各組細胞樣本具有良好的重復性；另一方面，各組樣本之間的距離相對較遠，表明其基因轉錄


本文編號：3318947