發(fā)布時間：2021-08-02 19:44

　　枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）作為一種重要的革蘭氏陽性菌,在工業(yè)生物技術(shù)以及合成生物學領(lǐng)域被廣泛用于代謝工程、重組蛋白表達以及用作新型疫苗的運載體,是一種極具應用前景的新型合成生物學底盤。目前在B.subtilis中所使用的基因表達調(diào)控元件有限,主要是組成型或誘導型啟動子以及終止子等,高精準性的人工調(diào)控工具較少,并且這類元件易受到底盤細胞內(nèi)源遺傳系統(tǒng)的干擾,影響基因線路的功能。因此亟待開發(fā)新的基因調(diào)控工具以充分挖掘B.subtilis在合成生物學中的應用。RNA分子元件的調(diào)節(jié)不依賴底盤細胞自身的反式作用因子,因此具有良好的正交性,有較大的應用潛力。本研究成功地在B.subtilis中構(gòu)建出了基于核酶和人工適體域的適體核酶分子開關(guān),實現(xiàn)了對外源基因的調(diào)控,并系統(tǒng)考察了這一元件在不同遺傳環(huán)境中的性能。具體研究結(jié)果如下:（1）以B.subtilis為宿主,驗證曼氏血吸蟲錘頭狀核酶的功能,證明其可用性。據(jù)此構(gòu)建了表達質(zhì)粒pP43RZGFP,利用核酶調(diào)控報告基因GFP的表達,檢測茶堿及DMSO對核酶功能的影響。結(jié)果顯示,含有核酶元件RZ的枯草芽胞菌株P(guān)BP43RZGFP表達G... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

茶堿結(jié)構(gòu)示意圖

圖 2-1 茶堿適體核酶調(diào)控基因表達原理示意圖Fig. 2-1 Schematic diagram of the regulatory function of theophylline aptazyme了進一步探究茶堿適體核酶的調(diào)控性能，構(gòu)建了不同啟動子匹配茶堿核糖粒進行功能分析和對比�；诓鑹A調(diào)控的核糖開關(guān)(圖 2-2)在未加入茶堿在莖環(huán)內(nèi)，核糖體無法結(jié)合 SD，基因無法進行表達；加入茶堿配體后，發(fā)生改變，SD 被暴露出來，翻譯開始進行。根據(jù)啟動子序列設計引物(表 pBSG11/pP43EGFP[32]為模板進行全質(zhì)粒 PCR，替換啟動子 P43，測序驗得含有不同啟動子與茶堿核糖開關(guān) E 組合匹配的重組質(zhì)粒 pPrpoBEGFP、pPspoVGEGFP、pPminCEGFP、pPsigWEGFP 和 pPyqeZEGFP。將轉(zhuǎn)入 B. subtilis 168 中，獲得含有茶堿核糖開關(guān)與不同啟動子組合匹配的基

圖 2-1 茶堿適體核酶調(diào)控基因表達原理示意圖Fig. 2-1 Schematic diagram of the regulatory function of theophylline aptazyme進一步探究茶堿適體核酶的調(diào)控性能，構(gòu)建了不同啟動子匹配茶堿核進行功能分析和對比�；诓鑹A調(diào)控的核糖開關(guān)(圖 2-2)在未加入茶堿莖環(huán)內(nèi)，核糖體無法結(jié)合 SD，基因無法進行表達；加入茶堿配體后生改變，SD 被暴露出來，翻譯開始進行。根據(jù)啟動子序列設計引物(BSG11/pP43EGFP[32]為模板進行全質(zhì)粒 PCR，替換啟動子 P43，測序含有不同啟動子與茶堿核糖開關(guān) E 組合匹配的重組質(zhì)粒 pPrpoBFP、pPspoVGEGFP、pPminCEGFP、pPsigWEGFP 和 pPyqeZEGFP。入 B. subtilis 168 中，獲得含有茶堿核糖開關(guān)與不同啟動子組合匹配的

【參考文獻】：
期刊論文
[1]核糖開關(guān)及其在抗菌藥物方面的研究進展[J]. 盛樹悅,陳悅,張興梅,石玉生.  生物技術(shù)通報. 2017(01)
[2]通過串聯(lián)啟動子實現(xiàn)納豆激酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達[J]. 葛春蕾,劉中美,崔文璟,周麗,郭軍玲,胡云峰,周哲敏.  現(xiàn)代食品科技. 2016(11)
[3]枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)及其啟動子研究進展[J]. 余小霞,田健,劉曉青,伍寧豐.  生物技術(shù)通報. 2015(02)
[4]食品級枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的最新研究進展[J]. 王金斌,陳大超,李文,蔣瑋,李鵬,張倩倩,唐雪明.  上海農(nóng)業(yè)學報. 2014(01)
[5]新型基因表達調(diào)控元件——人工核糖開關(guān)的構(gòu)建及篩選[J]. 楊會勇,刁勇,林俊生,許瑞安.  生物工程學報. 2012(02)
[6]核糖開關(guān)與基因表達調(diào)控[J]. 韓祥東,劉薇,吳存祥,馮永君.  中國生物化學與分子生物學報. 2011(12)
[7]納豆激酶基因在釀酒酵母中的表達[J]. 王開敏,趙敏,王福新.  中國食品學報. 2009(04)
[8]納豆激酶基因的克隆及其在枯草桿菌中的表達[J]. 劉北域,宋后燕.  生物化學與生物物理學報. 2002(03)
[9]納豆激酶穩(wěn)定性的研究[J]. 董明盛,江曉,劉誠,江漢湖.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2001(04)
[10]納豆激酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達[J]. 黃志立,羅立新,凌均建,楊汝德,梁世中.  廣東藥學院學報. 2000(04)

博士論文
[1]新型耐熱普魯蘭酶的篩選、分子改良及固定化研究[D]. 王劍鋒.江南大學 2018

碩士論文
[1]Bacillus natto納豆激酶的重組表達及熱穩(wěn)定性改造[D]. 何孝天.江南大學 2014



本文編號：3318162