發(fā)布時間：2021-07-30 22:43

　　基因表達(dá)調(diào)控是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的熱點話題,隨著研究手段的不斷成熟,其RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控已成為備受關(guān)注的領(lǐng)域。RNA結(jié)合蛋白（RBPs）是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子,參與RNA可變剪切、RNA穩(wěn)定、翻譯等多個過程的調(diào)控。ErbB3綁定蛋白（EBP1）是結(jié)構(gòu)功能高度保守的RNA結(jié)合蛋白,可與rRNA、tRNA、mRNA等多種RNA結(jié)合,參與調(diào)控核糖體生物生成、蛋白質(zhì)翻譯多個過程,但目前已報道的靶RNA甚少,對靶RNA的作用機(jī)制目前仍不清楚。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)擬南芥EBP1結(jié)合RNA的保守結(jié)構(gòu)域,并在體外可直接結(jié)合"GUCUCUCACUGCGACGGCUU"序列;通過RNA免疫共沉淀實驗找到了3個靶mRNA（AT1G24792、AT3G25211、AT3G24320）;結(jié)合核糖體提取及蟲草素處理實驗發(fā)現(xiàn)EBP1可顯著調(diào)控特定靶mRNA的穩(wěn)定性及其翻譯速率。研究結(jié)果不僅證實擬南芥EBP1具有結(jié)合RNA的功能,還顯示其參與調(diào)控靶RNA的轉(zhuǎn)錄后事件,為進(jìn)一步研究EBP1在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：生物技術(shù)通報. 2020,36(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

EBP1蛋白結(jié)構(gòu)域分析

表2 樣品濃度及吸光值 Sample OD260 OD260/280 RNA/(μg·mL-1) 顯著性(與GSTAgarose相比) GST Agarose 0.0191 1.9256 0.0412 IP:GST 0.0213 1.9113 0.0448 P＞0.05 IP:EBP1-GST 0.0413 2.0511 0.1324 **P＜0.01進(jìn)一步表達(dá)并純化了EBP1-GST蛋白(圖2-B),然后合成FITC修飾的探針“GUCUCUCACU-GCGACGGCUU”(Probes)以及不修飾的探針“GU-CUCUCACUGCGACGGCUU”(Competitor),通過與EBP1-GST、GST蛋白孵育,同時用50倍和100倍的不修飾的特異性探針(Competitor)進(jìn)行RNA-EMSA實驗。實驗結(jié)果表明:對照組GST純化柱(第一泳道)和GST(第二泳道)蛋白與探針孵育的泳道沒有出現(xiàn)遷移的電泳條帶,EBP1-GST與探針孵育泳道(第三泳道),顯示出明顯遷移的電泳條帶,且條帶的強(qiáng)度隨著競爭性探針(Competitor)濃度的升高而減弱(第四、五泳道)。表明GST蛋白不能結(jié)合RNA,而EBP1蛋白可以直接綁定“GUCUCUCA-CUGCGACGGCUU”這一RNA序列(圖2-C)。

為了研究EBP1對靶RNA轉(zhuǎn)錄后事件的調(diào)控,首先我們分析了EBP1對基因AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211在RNA穩(wěn)定性方面的影響。利用蟲草素這種轉(zhuǎn)錄抑制劑,結(jié)合qRT-PCR技術(shù)檢測靶RNA的降解速度,進(jìn)而分析RNA的穩(wěn)定性。于是對Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株用蟲草素處理后,進(jìn)行qRT-PCR檢測。ATHSPRO2基因是一個已被報道m(xù)RNA不穩(wěn)定的基因,蟲草素處理后ATHSPRO2 mRNA會迅速降解,證明蟲草素處理有效(圖4-A)。Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株在蟲草素處理0 min時這3個靶基因的mRNA含量均為1。相對于0 min mRNA含量,EBP1突變后AT1G24792 mRNA的含量在蟲草素處理30 min、45 min分別為0.574 7、0.218,而對照組Col-0中AT1G24792 mRNA分別是0.33、0.03,過表達(dá)EBP1-GFP AT1G24792 mRNA含量在30 min、45 min分別為0.301 58、0.046 03(圖4-B);EBP1突變后AT3G24320 mRNA在處理15 min、30 min后含量分別為0.222、0.191 1,對照組Col-0中AT3G24320 mRNA在蟲草素處理15 min、30 min時的相對含量是0.642 8、0.33,過表達(dá)EBP1-GFP AT3G24320 mRNA含量在15 min、30 min分別為0.202 5、0.13(圖4-C);EBP1突變后蟲草素處理15 min、45 min后AT1G25211 mRNA相對含量分別是0.807 3、0.218 4,Col-0被蟲草素處理15 min、45 min后AT1G25211 mRNA相對含量分別是0.802 0、0.263 9(圖4-D)。以上數(shù)據(jù)表明:EBP1促進(jìn)AT1G24792、AT3G24320 mRNA的降解,而對AT1G25211mRNA的穩(wěn)定性沒有影響。進(jìn)一步我們通過qRT-PCR手段檢測Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP植物中靶mRNA的含量(圖4-E-G)。數(shù)據(jù)顯示AT1G24792 mRNA在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP的相對含量為1.660 57、4.297 34、5.955 5、1.904 86、0.873 17,即AT1G24792 mRNA在ebp1-1、ebp1-2中明顯增多(P<0.05),而在過表達(dá)中mRNA沒有顯著改變(P>0.05)(圖4-E)。AT3G24320的mRNA相對含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分別為1.034 72、2.661 91、2.310 78、4.561 03、0.392 15,即EBP1突變后AT3G24320 mRNA的含量增加(P<0.05),EBP1過表達(dá)AT3G24320 mRNA的含量減少(P<0.05)(圖4-F)。AT1G25211的mRNA相對含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分別為1、0.567 20、0.426 91、0.659 82、1.466 62,表明EBP1對AT1G25211的mRNA含量沒有顯著影響(P>0.05)(圖4-G)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物RNA結(jié)合蛋白研究進(jìn)展[J]. 張在寶,李婉杰,李九麗,張弛,胡夢輝,程琳,袁紅雨.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(21)
[2]RNA結(jié)合蛋白與RNA相互作用鑒定技術(shù)[J]. 陳偉,許馨,孫紹光.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2017(02)
[3]細(xì)菌RNA結(jié)合蛋白Hfq研究進(jìn)展[J]. 郭英飛,袁玖云,王玉飛,崔明全.  解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志. 2015(05)
[4]RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的作用機(jī)制[J]. 高媛,馬大鵬,肖建華.  微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展. 2012(02)



本文編號：3312261