CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins）是細菌抵抗外來入侵的一種自適應免疫機制,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可實現(xiàn)雙鏈DNA的剪切并誘導宿主細胞DNA修復機制,從而達到靶向編輯基因的目的。核酸酶失活的Cas9（Nuclease-deactivated Cas9,d Cas9）耦聯(lián)效應分子可以調(diào)控靶標結合位點附近基因的表達、表觀遺傳修飾及特異染色體區(qū)域標記。目前已開發(fā)出多種CRISPR/Cas9系統(tǒng),可對活細胞中重復或低重復序列基因位點進行實時多位點同步成像,廣泛應用于動物和植物細胞中。基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的活細胞染色體成像技術為研究活細胞染色體動力學和三維染色體結構提供了全新角度。本研究針對CRISPR/Cas系統(tǒng)的生源機制及其在活細胞成像的應用和發(fā)展現(xiàn)狀進行概述,以期為該領域的相關研究提供參考。 

【文章來源】：天津農(nóng)業(yè)科學. 2020,26(01)

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9的作用機制

d Cas9與e GFP(enhanced Green FluorescentProtein,eGFP）融合表達后，dCas9-eGFP復合體與sgRNA在細胞內(nèi)組裝成有功能的復合體，待復合體結合到靶標DNA后，可通過熒光顯微鏡對活細胞中端粒等高重復染色體區(qū)域進行動態(tài)觀察。在非重復基因座上靶向36～73個sgRNA，該系統(tǒng)能夠觀測到MUC4基因座內(nèi)的非重復基因組區(qū)域。為實現(xiàn)多個gRNA的復用并將數(shù)十個不同的g RNAs高效遞送到單細胞中，Gu等[14]擴展了dCas9-eGFP成像方法，開發(fā)了一種稱為嵌合gRNA寡核苷酸陣列（Chimeric Array of g RNA Oligonucleotides,CARGO）的技術。CARGO技術將幾十個不同的gRNAs組成陣列遞送到單細胞中，從而精確識別獨特的非重復DNA片段，再利用多種熒光分子對其進行標記，實現(xiàn)了對特異DNA片段的動態(tài)觀測。利用該技術，Gu等[14]定量地測定了胚胎干細胞中發(fā)生分化相關活性的增強子和啟動子的運動變化情況。由于dCas9蛋白傾向定位在核仁中，dCas9-eGFP方法在核仁中會引發(fā)較高的背景信號。為了增強熒光信號強度和提升信噪比，可用更多的熒光蛋白（Fluorescent Protein,FP）分子標記dCas9，例如通過使用超新星標記系統(tǒng)（Sun-Tag），即利用一般對照不可誘導4號（General Control Non-Inducible 4,GCN4）肽序列與特異納米抗體之間相互作用募集多個FP[15]。利用dCas9-SunTag可以實現(xiàn)僅用20種不同的sgRNA就能連續(xù)跟蹤MUC4基因的非重復區(qū)域[16-17]。

熒光原位雜交（Fluorescencein Situ Fybridization,FISH）技術是利用與熒光基團耦合的核苷酸作為探針，在細胞內(nèi)與相應的靶DNA或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號而對組織、細胞或染色體上DNA或RNA進行定性或定位分析的一種技術[20]（圖3）。FISH迄今已發(fā)展了30多年，其在識別DNA和RNA序列方面具有高度敏感性和特異性，并且能在單細胞水平上同時對多個染色體位點進行可視化追蹤[21]，因此在解決單個染色體或整個基因組的結構、突變和進化等有關方面得到了廣泛應用[22]。但由于DNA FISH需要經(jīng)過甲酰胺和熱處理使DNA變性以便于與熒光核酸探針進行雜交，該過程可能會對生物體結構和基因組織的完整性造成破壞，無法準確的反映其原有空間結構[23]。CASFISH(Cas9-mediated FISH）利用CRISPR/Cas9復合物具有識別特異靶DNA的特性來標記序列特異性的染色體位點[24],DNA不需要經(jīng)過變性處理，有利于保留細胞形態(tài)和基因組結構。CASFISH既可對含有高重復序列的染色體位點進行標記，也可通過使用多個sgRNA將Cas9-熒光蛋白復合物靶向目標位點，從而標記非重復染色體位點。不同熒光標記的d Cas9/sgRNA還可對細胞中的多個染色體位點進行同步多色標記，以便于研究多個染色體位點之間的空間關系。由于CASFISH是利用dCas9介導的酶促反應對特定序列進行標記，在優(yōu)化條件下15 min內(nèi)即可完成標記，相對DNA FISH方法更加快捷[24]。將d Cas9與Halo標簽融合，形成的dCas-Halo可用于各種熒光染料標記[24-25]，再利用靶向不同DNA序列的sgRNA組合，可增加熒光染料選用的靈活性和多樣性，并降低開發(fā)靶向多重基因位點熒光探針的成本。Takei等[26]和Guan等[27]提出了一種先跟蹤后識別（Track First and Identify Later）的策略，即將CRISPR/dCas系統(tǒng)和DNA Sequential FISH(seqFISH）相結合的方法來對活細胞內(nèi)的多個染色體位點進行動態(tài)追蹤（圖4）。首先用CRISPR/dCas9系統(tǒng)對多個染色體位點進行單色實時成像。當動態(tài)記錄結束時再將細胞固定，連續(xù)多次使用DNA FISH來識別每個位點的身份。這一方法將染色體位點的動態(tài)追蹤任務和這些位點的獨特識別分離，將CRISPR標記和seqFISH兩者優(yōu)勢相結合，實現(xiàn)了在單一顏色通道下對活細胞的多個染色體位點的動態(tài)追蹤。為了能夠在實時成像之后快速且連續(xù)的進行DNA FISH操作，Guan等[27]優(yōu)化了FISH方法，使得整個染色過程能在1 min內(nèi)完成，極大地縮短了試驗周期。每輪成像檢測后利用甲酰胺溶液洗滌以去除上一輪結合的DNA探針，避免連續(xù)多次FISH試驗中DNA探針信號之間的干擾。利用該方法可同時對7個染色體位點進行鑒定，DNA FISH經(jīng)過20多輪的染色和洗滌后，仍能保持高強度的熒光信號和高效率的清洗效果[27]。這種將實時和固定成像聯(lián)合使用的方法同樣可用于RNA-FISH中對多個靶標RNA成像。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Progress and Challenges for Live-cell Imaging of Genomic Loci Using CRISPR-based Platforms[J]. Xiaotian Wu,Shiqi Mao,Yachen Ying,Christopher J.Krueger,Antony K.Chen.  Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2019(02)



本文編號：3302315