CRISPR/Cas系統(tǒng)在活細(xì)胞染色體成像中的應(yīng)用
發(fā)布時(shí)間：2021-07-25 15:47
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins）是細(xì)菌抵抗外來(lái)入侵的一種自適應(yīng)免疫機(jī)制,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)雙鏈DNA的剪切并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制,從而達(dá)到靶向編輯基因的目的。核酸酶失活的Cas9（Nuclease-deactivated Cas9,d Cas9）耦聯(lián)效應(yīng)分子可以調(diào)控靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)附近基因的表達(dá)、表觀遺傳修飾及特異染色體區(qū)域標(biāo)記。目前已開(kāi)發(fā)出多種CRISPR/Cas9系統(tǒng),可對(duì)活細(xì)胞中重復(fù)或低重復(fù)序列基因位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)多位點(diǎn)同步成像,廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和植物細(xì)胞中。基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的活細(xì)胞染色體成像技術(shù)為研究活細(xì)胞染色體動(dòng)力學(xué)和三維染色體結(jié)構(gòu)提供了全新角度。本研究針對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的生源機(jī)制及其在活細(xì)胞成像的應(yīng)用和發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行概述,以期為該領(lǐng)域的相關(guān)研究提供參考。
【文章來(lái)源】：天津農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020,26(01)
【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)
【部分圖文】：
CRISPR/Cas9的作用機(jī)制
d Cas9與e GFP(enhanced Green FluorescentProtein,eGFP）融合表達(dá)后，dCas9-eGFP復(fù)合體與sgRNA在細(xì)胞內(nèi)組裝成有功能的復(fù)合體，待復(fù)合體結(jié)合到靶標(biāo)DNA后，可通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)活細(xì)胞中端粒等高重復(fù)染色體區(qū)域進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。在非重復(fù)基因座上靶向36～73個(gè)sgRNA，該系統(tǒng)能夠觀測(cè)到MUC4基因座內(nèi)的非重復(fù)基因組區(qū)域。為實(shí)現(xiàn)多個(gè)gRNA的復(fù)用并將數(shù)十個(gè)不同的g RNAs高效遞送到單細(xì)胞中，Gu等[14]擴(kuò)展了dCas9-eGFP成像方法，開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為嵌合gRNA寡核苷酸陣列（Chimeric Array of g RNA Oligonucleotides,CARGO）的技術(shù)。CARGO技術(shù)將幾十個(gè)不同的gRNAs組成陣列遞送到單細(xì)胞中，從而精確識(shí)別獨(dú)特的非重復(fù)DNA片段，再利用多種熒光分子對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特異DNA片段的動(dòng)態(tài)觀測(cè)。利用該技術(shù)，Gu等[14]定量地測(cè)定了胚胎干細(xì)胞中發(fā)生分化相關(guān)活性的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的運(yùn)動(dòng)變化情況。由于dCas9蛋白傾向定位在核仁中，dCas9-eGFP方法在核仁中會(huì)引發(fā)較高的背景信號(hào)。為了增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度和提升信噪比，可用更多的熒光蛋白（Fluorescent Protein,FP）分子標(biāo)記dCas9，例如通過(guò)使用超新星標(biāo)記系統(tǒng)（Sun-Tag），即利用一般對(duì)照不可誘導(dǎo)4號(hào)（General Control Non-Inducible 4,GCN4）肽序列與特異納米抗體之間相互作用募集多個(gè)FP[15]。利用dCas9-SunTag可以實(shí)現(xiàn)僅用20種不同的sgRNA就能連續(xù)跟蹤MUC4基因的非重復(fù)區(qū)域[16-17]。
熒光原位雜交（Fluorescencein Situ Fybridization,FISH）技術(shù)是利用與熒光基團(tuán)耦合的核苷酸作為探針，在細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)的靶DNA或RNA分子雜交，通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)而對(duì)組織、細(xì)胞或染色體上DNA或RNA進(jìn)行定性或定位分析的一種技術(shù)[20]（圖3）。FISH迄今已發(fā)展了30多年，其在識(shí)別DNA和RNA序列方面具有高度敏感性和特異性，并且能在單細(xì)胞水平上同時(shí)對(duì)多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行可視化追蹤[21]，因此在解決單個(gè)染色體或整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)、突變和進(jìn)化等有關(guān)方面得到了廣泛應(yīng)用[22]。但由于DNA FISH需要經(jīng)過(guò)甲酰胺和熱處理使DNA變性以便于與熒光核酸探針進(jìn)行雜交，該過(guò)程可能會(huì)對(duì)生物體結(jié)構(gòu)和基因組織的完整性造成破壞，無(wú)法準(zhǔn)確的反映其原有空間結(jié)構(gòu)[23]。CASFISH(Cas9-mediated FISH）利用CRISPR/Cas9復(fù)合物具有識(shí)別特異靶DNA的特性來(lái)標(biāo)記序列特異性的染色體位點(diǎn)[24],DNA不需要經(jīng)過(guò)變性處理，有利于保留細(xì)胞形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)。CASFISH既可對(duì)含有高重復(fù)序列的染色體位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，也可通過(guò)使用多個(gè)sgRNA將Cas9-熒光蛋白復(fù)合物靶向目標(biāo)位點(diǎn)，從而標(biāo)記非重復(fù)染色體位點(diǎn)。不同熒光標(biāo)記的d Cas9/sgRNA還可對(duì)細(xì)胞中的多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行同步多色標(biāo)記，以便于研究多個(gè)染色體位點(diǎn)之間的空間關(guān)系。由于CASFISH是利用dCas9介導(dǎo)的酶促反應(yīng)對(duì)特定序列進(jìn)行標(biāo)記，在優(yōu)化條件下15 min內(nèi)即可完成標(biāo)記，相對(duì)DNA FISH方法更加快捷[24]。將d Cas9與Halo標(biāo)簽融合，形成的dCas-Halo可用于各種熒光染料標(biāo)記[24-25]，再利用靶向不同DNA序列的sgRNA組合，可增加熒光染料選用的靈活性和多樣性，并降低開(kāi)發(fā)靶向多重基因位點(diǎn)熒光探針的成本。Takei等[26]和Guan等[27]提出了一種先跟蹤后識(shí)別（Track First and Identify Later）的策略，即將CRISPR/dCas系統(tǒng)和DNA Sequential FISH(seqFISH）相結(jié)合的方法來(lái)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤（圖4）。首先用CRISPR/dCas9系統(tǒng)對(duì)多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行單色實(shí)時(shí)成像。當(dāng)動(dòng)態(tài)記錄結(jié)束時(shí)再將細(xì)胞固定，連續(xù)多次使用DNA FISH來(lái)識(shí)別每個(gè)位點(diǎn)的身份。這一方法將染色體位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)追蹤任務(wù)和這些位點(diǎn)的獨(dú)特識(shí)別分離，將CRISPR標(biāo)記和seqFISH兩者優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了在單一顏色通道下對(duì)活細(xì)胞的多個(gè)染色體位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)追蹤。為了能夠在實(shí)時(shí)成像之后快速且連續(xù)的進(jìn)行DNA FISH操作，Guan等[27]優(yōu)化了FISH方法，使得整個(gè)染色過(guò)程能在1 min內(nèi)完成，極大地縮短了試驗(yàn)周期。每輪成像檢測(cè)后利用甲酰胺溶液洗滌以去除上一輪結(jié)合的DNA探針，避免連續(xù)多次FISH試驗(yàn)中DNA探針信號(hào)之間的干擾。利用該方法可同時(shí)對(duì)7個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，DNA FISH經(jīng)過(guò)20多輪的染色和洗滌后，仍能保持高強(qiáng)度的熒光信號(hào)和高效率的清洗效果[27]。這種將實(shí)時(shí)和固定成像聯(lián)合使用的方法同樣可用于RNA-FISH中對(duì)多個(gè)靶標(biāo)RNA成像。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Progress and Challenges for Live-cell Imaging of Genomic Loci Using CRISPR-based Platforms[J]. Xiaotian Wu,Shiqi Mao,Yachen Ying,Christopher J.Krueger,Antony K.Chen. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2019(02)
本文編號(hào)：3302315
【文章來(lái)源】：天津農(nóng)業(yè)科學(xué). 2020,26(01)
【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)
【部分圖文】：
CRISPR/Cas9的作用機(jī)制
d Cas9與e GFP(enhanced Green FluorescentProtein,eGFP）融合表達(dá)后，dCas9-eGFP復(fù)合體與sgRNA在細(xì)胞內(nèi)組裝成有功能的復(fù)合體，待復(fù)合體結(jié)合到靶標(biāo)DNA后，可通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)活細(xì)胞中端粒等高重復(fù)染色體區(qū)域進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。在非重復(fù)基因座上靶向36～73個(gè)sgRNA，該系統(tǒng)能夠觀測(cè)到MUC4基因座內(nèi)的非重復(fù)基因組區(qū)域。為實(shí)現(xiàn)多個(gè)gRNA的復(fù)用并將數(shù)十個(gè)不同的g RNAs高效遞送到單細(xì)胞中，Gu等[14]擴(kuò)展了dCas9-eGFP成像方法，開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為嵌合gRNA寡核苷酸陣列（Chimeric Array of g RNA Oligonucleotides,CARGO）的技術(shù)。CARGO技術(shù)將幾十個(gè)不同的gRNAs組成陣列遞送到單細(xì)胞中，從而精確識(shí)別獨(dú)特的非重復(fù)DNA片段，再利用多種熒光分子對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特異DNA片段的動(dòng)態(tài)觀測(cè)。利用該技術(shù)，Gu等[14]定量地測(cè)定了胚胎干細(xì)胞中發(fā)生分化相關(guān)活性的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的運(yùn)動(dòng)變化情況。由于dCas9蛋白傾向定位在核仁中，dCas9-eGFP方法在核仁中會(huì)引發(fā)較高的背景信號(hào)。為了增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度和提升信噪比，可用更多的熒光蛋白（Fluorescent Protein,FP）分子標(biāo)記dCas9，例如通過(guò)使用超新星標(biāo)記系統(tǒng)（Sun-Tag），即利用一般對(duì)照不可誘導(dǎo)4號(hào)（General Control Non-Inducible 4,GCN4）肽序列與特異納米抗體之間相互作用募集多個(gè)FP[15]。利用dCas9-SunTag可以實(shí)現(xiàn)僅用20種不同的sgRNA就能連續(xù)跟蹤MUC4基因的非重復(fù)區(qū)域[16-17]。
熒光原位雜交（Fluorescencein Situ Fybridization,FISH）技術(shù)是利用與熒光基團(tuán)耦合的核苷酸作為探針，在細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)的靶DNA或RNA分子雜交，通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)而對(duì)組織、細(xì)胞或染色體上DNA或RNA進(jìn)行定性或定位分析的一種技術(shù)[20]（圖3）。FISH迄今已發(fā)展了30多年，其在識(shí)別DNA和RNA序列方面具有高度敏感性和特異性，并且能在單細(xì)胞水平上同時(shí)對(duì)多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行可視化追蹤[21]，因此在解決單個(gè)染色體或整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)、突變和進(jìn)化等有關(guān)方面得到了廣泛應(yīng)用[22]。但由于DNA FISH需要經(jīng)過(guò)甲酰胺和熱處理使DNA變性以便于與熒光核酸探針進(jìn)行雜交，該過(guò)程可能會(huì)對(duì)生物體結(jié)構(gòu)和基因組織的完整性造成破壞，無(wú)法準(zhǔn)確的反映其原有空間結(jié)構(gòu)[23]。CASFISH(Cas9-mediated FISH）利用CRISPR/Cas9復(fù)合物具有識(shí)別特異靶DNA的特性來(lái)標(biāo)記序列特異性的染色體位點(diǎn)[24],DNA不需要經(jīng)過(guò)變性處理，有利于保留細(xì)胞形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)。CASFISH既可對(duì)含有高重復(fù)序列的染色體位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，也可通過(guò)使用多個(gè)sgRNA將Cas9-熒光蛋白復(fù)合物靶向目標(biāo)位點(diǎn)，從而標(biāo)記非重復(fù)染色體位點(diǎn)。不同熒光標(biāo)記的d Cas9/sgRNA還可對(duì)細(xì)胞中的多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行同步多色標(biāo)記，以便于研究多個(gè)染色體位點(diǎn)之間的空間關(guān)系。由于CASFISH是利用dCas9介導(dǎo)的酶促反應(yīng)對(duì)特定序列進(jìn)行標(biāo)記，在優(yōu)化條件下15 min內(nèi)即可完成標(biāo)記，相對(duì)DNA FISH方法更加快捷[24]。將d Cas9與Halo標(biāo)簽融合，形成的dCas-Halo可用于各種熒光染料標(biāo)記[24-25]，再利用靶向不同DNA序列的sgRNA組合，可增加熒光染料選用的靈活性和多樣性，并降低開(kāi)發(fā)靶向多重基因位點(diǎn)熒光探針的成本。Takei等[26]和Guan等[27]提出了一種先跟蹤后識(shí)別（Track First and Identify Later）的策略，即將CRISPR/dCas系統(tǒng)和DNA Sequential FISH(seqFISH）相結(jié)合的方法來(lái)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤（圖4）。首先用CRISPR/dCas9系統(tǒng)對(duì)多個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行單色實(shí)時(shí)成像。當(dāng)動(dòng)態(tài)記錄結(jié)束時(shí)再將細(xì)胞固定，連續(xù)多次使用DNA FISH來(lái)識(shí)別每個(gè)位點(diǎn)的身份。這一方法將染色體位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)追蹤任務(wù)和這些位點(diǎn)的獨(dú)特識(shí)別分離，將CRISPR標(biāo)記和seqFISH兩者優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了在單一顏色通道下對(duì)活細(xì)胞的多個(gè)染色體位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)追蹤。為了能夠在實(shí)時(shí)成像之后快速且連續(xù)的進(jìn)行DNA FISH操作，Guan等[27]優(yōu)化了FISH方法，使得整個(gè)染色過(guò)程能在1 min內(nèi)完成，極大地縮短了試驗(yàn)周期。每輪成像檢測(cè)后利用甲酰胺溶液洗滌以去除上一輪結(jié)合的DNA探針，避免連續(xù)多次FISH試驗(yàn)中DNA探針信號(hào)之間的干擾。利用該方法可同時(shí)對(duì)7個(gè)染色體位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，DNA FISH經(jīng)過(guò)20多輪的染色和洗滌后，仍能保持高強(qiáng)度的熒光信號(hào)和高效率的清洗效果[27]。這種將實(shí)時(shí)和固定成像聯(lián)合使用的方法同樣可用于RNA-FISH中對(duì)多個(gè)靶標(biāo)RNA成像。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Progress and Challenges for Live-cell Imaging of Genomic Loci Using CRISPR-based Platforms[J]. Xiaotian Wu,Shiqi Mao,Yachen Ying,Christopher J.Krueger,Antony K.Chen. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2019(02)
本文編號(hào)：3302315
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