城市污水蘊(yùn)藏著多種潛在的病原體,一旦進(jìn)入動(dòng)植物體中會(huì)造成各種疾病的產(chǎn)生,而處理后的污水仍可能含有較高的微生物數(shù)量。噬菌體是感染細(xì)菌等微生物的病毒,具有很強(qiáng)的宿主特異性和多樣性。人們開(kāi)始利用噬菌體的特性進(jìn)行多個(gè)領(lǐng)域的病原體控制研究。實(shí)驗(yàn)所需的樣品來(lái)自北京排水集團(tuán)清河再生水廠。經(jīng)過(guò)富集分離得到了52株細(xì)菌菌株,并以它們?yōu)樗拗?特異性的分離得到了3株噬菌體。對(duì)這些噬菌體的噬菌譜、效價(jià)、感染復(fù)數(shù)和生長(zhǎng)曲線等生物學(xué)特性進(jìn)行分析,并利用透射電鏡、全基因組測(cè)序、拼接和功能注釋,對(duì)噬菌體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步探究。本次實(shí)驗(yàn)共分離出了52株細(xì)菌,將分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測(cè)序后,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列比對(duì)結(jié)果確定細(xì)菌種類。并以分離出的52株細(xì)菌作為潛在宿主來(lái)分離噬菌體,最終分別通過(guò)Raoultella ornithinolytica、Enterobacter kobei和Citrobacter freundii 3株細(xì)菌分離得到了3株對(duì)應(yīng)的噬菌體LW03、EK06、NM19。結(jié)果顯示3株噬菌體噬菌體LW03、EK06、NM19均可形成透明且邊緣清晰的噬菌斑;電鏡下觀察到3株噬菌體均有規(guī)則的正多... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線

14（10）仔細(xì)打開(kāi)QIAampMinispincolumn，并加入500uLBufferAW1，注意不能弄濕了管蓋的邊緣，蓋緊蓋子，靜置10mim，再8000rpm離心1min。將QIAampMinispincolumn放到另一個(gè)新的2mL收集管中。（11）仔細(xì)打開(kāi)QIAampMinispincolumn，并加入500uLBufferAW2，注意不能弄濕了管蓋的邊緣，蓋緊蓋子，靜置10mim，再全速離心3min。將QIAampMinispincolumn放到另一個(gè)新的2mL收集管中。（12）將QIAampMinispincolumn放置與一個(gè)新的2ml收集管中，全速離心1mim，幫助去除殘留的BufferAW2。（13）將QIAampMinispincolumn放置與一個(gè)新的1.5mLEP管中（自己準(zhǔn)備），仔細(xì)打開(kāi)QIAampMinispincolumn蓋子，并加入150ulBufferAE或滅菌后的去離子水，注意槍尖不要和膜接觸。（14）蓋緊蓋子，在室溫下放置2min，然后在14000rpm下離心1min。（15）重復(fù)（13）步驟的操作，使DNA洗脫更完全。將提取的DNA溶液送去北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S測(cè)序。將公司反饋回的序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTn進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)序列相似程度和親緣性來(lái)判斷細(xì)菌所在種屬。2.4結(jié)果與討論在一個(gè)城市污水處理廠中，其微生物的數(shù)量就可以達(dá)到1018個(gè)（Woodcocketal.，2006），其種類也極其豐富。通過(guò)對(duì)污水進(jìn)行梯度稀釋和平板涂布，可以挑取單菌落進(jìn)行分離純化（圖2-1）。圖2-1平板涂布后菌落生長(zhǎng)和分布狀態(tài)

23況等。3.5.4比較基因組和進(jìn)化分析利用基因組比對(duì)軟件Mauve2.3.1（Ryooetal.，2018）對(duì)多個(gè)噬菌體基因組序列進(jìn)行比較分析，計(jì)算基因組序列間的同源性，生成基因組比較的可視化圖形。本實(shí)驗(yàn)將噬菌體主要衣殼蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用MEGA（王澤宇等，2017），將各基因的氨基酸序列采用鄰接樹(shù)法（Neighbour-JoiningTree）做進(jìn)化關(guān)系分析繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。3.6結(jié)果與討論3.6.1結(jié)果本研究以水樣中分離純化得到的細(xì)菌為宿主菌，通過(guò)富集、分離和純化從污水樣本中篩選出3株噬菌體，經(jīng)多次純化后獲得圓形噬菌斑，形狀大小均一，透明度高。3株噬菌體的宿主菌分別為：Enterobacterkobei、Citrobacterfreundii以及Raoultellaornithinolytica，將這3株噬菌體分別命名為EK06、NM19和LW03。利用透射掃描電子顯微鏡對(duì)純化后的3株噬菌體的形態(tài)進(jìn)行觀察。3株噬菌體所形成的噬菌斑均為直徑2mm左右圓形透亮空斑，如圖3-1、3-2所示。圖3-1噬菌斑照片

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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碩士論文
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