發(fā)布時間：2021-07-14 11:18

　　【目的】通過構(gòu)建假交替單胞菌（Pseudoalteromonassp.DL-6）低溫幾丁質(zhì)酶（chitinaseA,chi A;chitinase C, chi C）的重組乳酸克魯維酵母菌株、純化重組蛋白并對其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征,為低溫幾丁質(zhì)酶潛在工業(yè)化生產(chǎn)幾丁寡糖奠定理論基礎(chǔ)�！痉椒ā咳斯ず铣擅艽a子優(yōu)化的幾丁質(zhì)酶基因,構(gòu)建重組乳酸克魯維酵母表達(dá)質(zhì)粒（p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C）并用電脈沖法轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母中,實(shí)現(xiàn)低溫幾丁質(zhì)酶的可溶表達(dá)。利用鎳柱親和層析純化得到高純度的重組幾丁質(zhì)酶。【結(jié)果】成功構(gòu)建產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的重組乳酸克魯維酵母并純化獲得高純度的重組幾丁質(zhì)酶。經(jīng)SDS-PAGE分析在110 k Da與90 k Da附近出現(xiàn)符合預(yù)期大小的蛋白條帶。鐵氰化鉀法測得Chi A和Chi C的酶活分別為51.45 U/mg與108.56 U/mg。最適反應(yīng)溫度分別為20°C和30°C,最適p H分別為8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0時,Chi A和Chi C重組酶較穩(wěn)定。Chi A和Chi C對膠體幾丁質(zhì)以及粉狀底物α-幾丁質(zhì)與β-幾丁質(zhì)... 

【文章來源】：微生物學(xué)報. 2020,60(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

chiA、chiC基因電泳結(jié)果

重組表達(dá)質(zhì)粒pKLAC2-chiA及pKLAC2-chiC的酶切鑒定

將K.lactis GG799/pKLAC2和重組菌株K.lactis GG799/p KLAC2-chi A、K.lactis GG799/p KLAC2-chiC在YPD培養(yǎng)基中，30°C、200 r/min培養(yǎng)48 h后離心取上清液經(jīng)Ni-NTA柱純化，如圖5與圖6所示。重組菌株發(fā)酵液上清與重組菌K.lactis/pKLAC2相比，重組菌K.lactis GG799/pKLAC2-chiA、K.lactis GG799/pKLAC2-chiC經(jīng)純化后在110 kDa和90 kDa附近可見單一蛋白條帶，說明在ChiA和ChiC在K.lactis GG799中得到有效的分泌表達(dá)。純化蛋白ChiA與ChiC的蛋白濃度分別為1.26 mg/mL與1.48 mg/mL，酶活力分別為51.45 U/mg與108.56 U/mg。圖4.酵母轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3284040