由于細胞代謝和調(diào)控網(wǎng)絡的復雜性,尤其是對于多基因調(diào)控的復雜性狀和遺傳工具有限的生物系統(tǒng)而言,基因組進化在微生物細胞工廠的構建中起著至關重要的作用�；蚪M進化通過人為創(chuàng)造多樣化性狀以及功能篩選的迭代循環(huán),在實驗室中模擬且加速自然進化的過程,從而快速獲得滿足目標需求的進化突變體。釀酒酵母是代謝工程中重要的底盤細胞,全基因組進化是對其進行系統(tǒng)性改造的最有效合成生物學手段之一。本文總結了基因組進化在構建高效的釀酒酵母細胞工廠中的技術進展和應用,包括基因組改組、轉座子插入誘變和全局轉錄機制工程（gTME）等基于隨機突變的非理性基因組進化以及諸如酵母寡核苷酸介導的基因組工程（YOGE）,真核基因組多重位點自動改造技術（eMAGE）、RNAi輔助的基因組進化方法 （RAGE）以及基于CRISPR體系的基因組規(guī)模改造技術（CHAnGE、MAGIC和MAGESTIC）等可示蹤的半理性基因組進化,并簡要介紹了基因組進化面臨的挑戰(zhàn)和高通量篩選方法的發(fā)展前景。 

【文章來源】：合成生物學. 2020,1(05)

【文章頁數(shù)】：14 頁

【部分圖文】：

釀酒酵母基因組進化的主要技術策略

RNA干擾（RNA interference,RNAi）是一種由雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默途徑，存在于多種真核生物中，但釀酒酵母缺乏天然的RNAi機制。有研究報道，通過異源表達芽殖酵母的RNAi相關蛋白Ago1和Dcr1，在釀酒酵母中成功重構了RNAi途徑[38]，這使得能夠利用RNAi篩選來快速了解和改造工程酵母中的復雜表型[圖2(a）]。隨后，Si等[31]開發(fā)了釀酒酵母中RNAi輔助的基因組進化方法RAGE。在CEN.PK2-1c中引入RNAi途徑后，根據(jù)酵母基因組DNA片段構建了雙鏈RNA庫，并利用該RNA庫篩選得到YKU70（與端粒酶功能缺失相關的基因）突變的兩個已知和三個未知的抑制基因。同時經(jīng)過3輪迭代的RNAi篩選，對3個基因PTC6、YPRP84W和t RNAVal(AAC）同時敲降后，顯著改善了釀酒酵母對乙酸的耐受性。Xiao等[39]利用RNAi全基因組進化，發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)SIZ1基因的表達水平，可以顯著提高釀酒酵母的糠醛耐受性。在RNAi基因組進化的基礎上，Si等[32]又開發(fā)了釀酒酵母自動化多重基因組進化技術。根據(jù)酵母基因組構建包括基因過表達和基因下調(diào)的全長c DNA文庫，其中基因過表達調(diào)控通過全長c DNA的表達實現(xiàn)，基因下調(diào)調(diào)控通過全長反義RNA的轉錄（RNAi）實現(xiàn)[圖2 (b）]。在CRISPR/Cas的幫助下，通過δ整合的方式將同源供體（donor）整合到酵母基因組上[圖2(c）]，并利用自動化平臺進行多輪迭代基因組進化提高釀酒酵母乙酸耐受性，最后篩選到的菌株在1.1%乙酸濃度下，4 d內(nèi)可將20 g/L葡萄糖轉化為5.9 g/L乙醇，且整個篩選過程在一個月內(nèi)就能完成。1.2.4 CHAn GE(CRISPR/Cas9-and homology-directedrepair-assisted genome-scale engineering)

利用CRISPR/Cas技術可以實現(xiàn)基因敲除，而在核酸酶失活的Cas蛋白（d Cas）上融合表達激活域或抑制域可以實現(xiàn)轉錄激活和抑制[41]。2017年，Lian等[42]開發(fā)了三功能CRISPR體系（CRISPR-AID），可以在一個細胞內(nèi)同時進行轉錄激活、轉錄抑制以及基因敲除。其中d Lb Cpf1-VP用于轉錄激活（CRISPRa),d Sp Cas9-RD1152用于轉錄抑制（CRISPRi),Sa Cas9用于基因敲除（CRISPRd）。利用CRISPR-AID和寡核苷酸芯片技術，Lian等[34]又發(fā)展了多功能全基因組進化技術MAGIC（圖3），構建了最全面最多樣化的酵母基因組文庫。根據(jù)酵母基因組對基因敲除、轉錄激活和轉錄抑制分別設計不同的g RNA，構建基因敲除、轉錄激活和轉錄抑制3個質粒庫，將這3個質粒庫同時轉入釀酒酵母中，通過高通量篩選實現(xiàn)基因組進化，而g RNA可以作為獨特的基因條形碼，可通過二代測序進行追蹤。利用MAGIC技術，他們鑒定了復雜表型（糠醛耐受性和蛋白表面展示）一些之前未知的遺傳決定因素。比如在5 mmol/L糠醛濃度下除了篩選到和糠醛耐受性相關的已知靶點SIZ1和SAP30，還篩選到了之前未發(fā)現(xiàn)的新的靶點SLX5、NUP133、GPI17和UME1。在SIZ1基因表達水平下調(diào)的菌株基礎上進行第2輪進化，一些與線粒體功能相關的靶點MRPL32、NAT1等被發(fā)現(xiàn)可以提高糠醛耐受性，但這些靶點依賴SIZ1基因的下調(diào)。第3輪進化在SIZ1基因表達水平下調(diào)及NAT1基因表達水平激活的菌株上進行，發(fā)現(xiàn)PDR1基因表達水平的下調(diào)可以進一步提高糠醛耐受性。最后經(jīng)過3輪進化的酵母菌能在17.5 mmol/L糠醛濃度下，兩天內(nèi)消耗掉大部分的葡萄糖（初始濃度20 g/L），且乙醇的最終濃度與對照菌株相當，說明該工程酵母菌株的中心代謝并沒有明顯改變。1.2.6 MAGESTIC(multiplexed accurate genome editingwith short,trackable,integrated cellular barcodes)


本文編號：3276764