CRISPR/Cas9核酸酶是一種高效和精確的基因組DNA編輯工具。目前,CRISPR/Cas9被開(kāi)發(fā)成一種新型抗菌劑,通過(guò)靶向破壞目標(biāo)基因,例如抗生素耐藥基因來(lái)誘導(dǎo)細(xì)菌死亡。本研究利用CRISPR攜帶多靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì),同時(shí)靶向大腸桿菌必需基因gyrA、gyrB和folA,以達(dá)到殺菌作用。本設(shè)計(jì)針對(duì)3個(gè)內(nèi)源基因的CRISPR系列載體,分別含有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)靶點(diǎn)。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)Cas9表達(dá)后,CRISPR RNA （crRNA）和反式作用CRISPR RNA （trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA）復(fù)合物募集Cas9切割靶基因,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。隨著crRNA中靶點(diǎn)數(shù)量的增加,殺菌效率顯著提高。當(dāng)含有3個(gè)靶點(diǎn)的crRNA作用于細(xì)菌基因組時(shí),殺菌效率達(dá)到99.35%。此外,在存活的大腸桿菌中,crRNA表達(dá)質(zhì)粒的靶序列和直接重復(fù)序列發(fā)現(xiàn)堿基缺失,而內(nèi)源靶基因和Cas9基因均未發(fā)生突變。最后,該CRISPR系統(tǒng)還應(yīng)用于其他大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株和產(chǎn)腸毒素K88菌株,并表現(xiàn)出高效的殺菌作用。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于CRISPR/Cas9核酸酶的新型抗菌劑,為抗菌劑的研發(fā)提供... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2020,36(09)北大核心CSCD

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【文章目錄】：
1 Materials and Methods
    1.1 Bacterial strains
    1.2 Construction of serial crRNA plasmids
    1.3 Construction of the Cas expression plasmid
    1.4 Measurement of bacterial growth inhibition
    1.4 Viability tests
    1.5 Target DNA amplification and sequencing
    1.6 Recovery plasmids from survival cells
    1.7 Statistical analysis
2 Results
    2.1 CRISPR/Cas9-induced bacteria deaths via targeting a single gene
    2.2 CRISPR/Cas9-induced bacteria death via targeting two or three genes
    2.3 Detection of target genes in survival colonies
    2.4 Detection of plasmids in survival colonies
    2.5 CRISPR-induced bacteria death efficiently in different E. coli strains
3 Discussion



本文編號(hào)：3272727