絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）產(chǎn)生的纖維素酶主要包括纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表達(dá)外源基因時(shí),它們會(huì)形成較高的纖維素酶背景,而且其表達(dá)還可能會(huì)導(dǎo)致對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌等相關(guān)資源的占用。應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù),在體外組裝Cas9/gRNA復(fù)合物并轉(zhuǎn)化里氏木霉以定點(diǎn)敲除主要的纖維二糖水解酶cbh1基因,同時(shí)結(jié)合RNAi干擾技術(shù)來沉默主要的內(nèi)切葡聚糖酶eg2基因,以期一步構(gòu)建里氏木霉低纖維素酶背景的表達(dá)系統(tǒng)。獲得了一株纖維素酶表達(dá)顯著下降的11號(hào)轉(zhuǎn)化子SUS6。該轉(zhuǎn)化子中,cbh1的表達(dá)完全消失,而eg2基因的表達(dá)水平較出發(fā)菌株SUS5降低了98%。以該轉(zhuǎn)化子為宿主表達(dá)外源基因NfBgl3A,兩個(gè)代表性轉(zhuǎn)化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分別為172.4和79.3 U·mL^-1,遠(yuǎn)高于以出發(fā)菌株（高纖維素酶背景）為宿主表達(dá)β-葡萄糖苷酶酶活(兩個(gè)代表轉(zhuǎn)化子分別為11.6和31.9 U·mL^-1)。因此,構(gòu)建低纖維素酶背景的菌株作為表達(dá)宿主,還可明顯的提高某些異源基因的表達(dá)水平。 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào). 2020,22(12)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

轉(zhuǎn)化子中CBH1和EG2分泌表達(dá)情況

將成功構(gòu)建的pEG2i質(zhì)粒和Cas9/gRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)入里氏木霉SUS5菌株。理論上除了對eg2基因進(jìn)行RNAi介導(dǎo)的基因沉默外,還能依賴于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對cbh1基因進(jìn)行敲除。驗(yàn)證引物分別設(shè)計(jì)在gRNA識(shí)別cbh1位點(diǎn)的前后大約250 bp處。從圖1可以看出,以出發(fā)菌株SUS5作模板擴(kuò)增出500 bp左右的特異性條帶,和預(yù)期大小相符;以大部分轉(zhuǎn)化子為模板擴(kuò)增,雖然擴(kuò)增出了此特異性條帶,但經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)和基因組序列完全一致,未能發(fā)生有效的基因組編輯。而5號(hào)、8號(hào)和11號(hào)轉(zhuǎn)化子均未能擴(kuò)增出特異性條帶。根據(jù)使用Cas9/gRNA復(fù)合物對里氏木霉基因組編輯的報(bào)道[10],里氏木霉中使用體外組裝的Cas9/gRNA編輯基因時(shí)主要發(fā)生較大DNA片段的插入,這些片段包括染色體DNA、質(zhì)粒DNA或污染的大腸桿菌的染色體DNA。因此,這些轉(zhuǎn)化子中有可能發(fā)生cbh1基因組座位的編輯。2.2 選定轉(zhuǎn)化子中CBH1和EG2分泌表達(dá)情況

SUS6菌株中NfBgl3A表達(dá)增強(qiáng)


本文編號(hào)：3270640