【目的】為了研究基因組編輯工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂（DNA doublestrandbreak,DSB）對(duì)釀酒酵母DNA的損傷作用及修復(fù)響應(yīng)情況,對(duì)比化學(xué)物質(zhì)甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate,MMS）對(duì)釀酒酵母基因組DNA的損傷和修復(fù),闡明編輯細(xì)胞在細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)錄水平上的變化。【方法】起始細(xì)胞分為兩種情況,包括未進(jìn)行細(xì)胞周期同步化和被α-因子同步化細(xì)胞周期至G0/G1期。檢測(cè)CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1處理后編輯細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)編輯細(xì)胞的細(xì)胞周期延滯的情況。利用熒光定量PCR檢測(cè)編輯細(xì)胞和MMS處理細(xì)胞后DNA損傷響應(yīng)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化情況�！窘Y(jié)果】起始細(xì)胞無論是未同步化還是同步化,其生長(zhǎng)均受到基因組編輯抑制,細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞周期被滯留在G2/M期,而MMS處理導(dǎo)致細(xì)胞周期S期的滯留。此外,隨編輯時(shí)間的延長(zhǎng),突變率增加,細(xì)胞存活率降低。CRISPR/Cpf1編輯細(xì)胞的突變率和存活率均低于CRISPR/Cas9,由此可見,CRISPR/Cpf1對(duì)細(xì)胞的損傷強(qiáng)度高于C... 

【文章來源】：微生物學(xué)報(bào). 2020,60(07)北大核心CSCD

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未同步化和α-因子同步化細(xì)胞的基因組編輯效果評(píng)價(jià)

攜帶編輯質(zhì)粒和空質(zhì)粒的菌株(表1)各挑取2個(gè)單菌落分別接種到10 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。分成2份，其中一份利用α-因子進(jìn)行細(xì)胞周期同步化處理。以初始OD600=0.4轉(zhuǎn)接到20 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura中，搖瓶中加入5μg/mLα-因子，30°C、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)；另一份不經(jīng)過細(xì)胞周期的同步化。然后，將經(jīng)過細(xì)胞周期同步化的菌體和未經(jīng)過細(xì)胞周期同步化的菌體各自以初始OD600=0.4分別轉(zhuǎn)接到下列2種培養(yǎng)基中：(1)20 mL含有20 g/L半乳糖的SD-His液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)編輯；(2)20 mL含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura液體培養(yǎng)基，作為未誘導(dǎo)編輯的陰性對(duì)照。每個(gè)菌株每個(gè)培養(yǎng)基條件設(shè)置兩組生物學(xué)平行。在30°C、250 r/min條件下培養(yǎng)36 h，定期取樣，測(cè)定OD600，繪制生長(zhǎng)曲線。為了計(jì)算編輯后的存活率和突變率，按照上述同樣的方法培養(yǎng)菌液，定期取樣，10倍梯度稀釋，分別涂布于含有20 g/L葡萄糖的SD-His-Ura平板和含有20 g/L葡萄糖以及0.15%5-FOA的SD-His平板上，30°C靜止培養(yǎng)36 h，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，按照?qǐng)D1所示，計(jì)算存活率和突變率，即細(xì)胞存活率是用半乳糖誘導(dǎo)編輯的細(xì)胞在SD-His平板上生長(zhǎng)的單菌落數(shù)目除以葡萄糖未誘導(dǎo)編輯的細(xì)胞在SD-His-Ura平板上生長(zhǎng)的單菌落數(shù)目；突變率是半乳糖誘導(dǎo)編輯的細(xì)胞在含有5-FOA的SD-His平板上生長(zhǎng)的單菌落數(shù)目除以在SD-His平板上生長(zhǎng)的單菌落數(shù)目。1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

影響，我們對(duì)編輯細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中的存活率和突變率進(jìn)行了檢測(cè)。在起始細(xì)胞未進(jìn)行細(xì)胞周期同步化的情況下，無論是CRISPR/Cas9還是CRISPR/Cpf1介導(dǎo)的編輯，隨著編輯時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，分別從8 h時(shí)間點(diǎn)的33.1‰和20.5‰逐漸下降到36 h時(shí)間點(diǎn)的3.2‰和1.2‰，分別下降了10倍和17倍；而編輯突變率逐漸升高，即發(fā)生易錯(cuò)修復(fù)的細(xì)胞比例逐漸升高，分別從12 h時(shí)間點(diǎn)的1.9‰和0.1‰升高到36 h時(shí)間點(diǎn)的14.4‰和1.7‰，分別升高了8倍和17倍(圖3-A)。而且CRISPR/Cpf1對(duì)細(xì)胞的損傷強(qiáng)度高于CRISPR/Cas9，因?yàn)樵谙嗤木庉嫊r(shí)間點(diǎn)，前者的細(xì)胞存活率和突變率均低于后者。在起始細(xì)胞被α-因子同步化細(xì)胞周期至G0/G1期的情況下，隨著編輯時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率和編輯突變率的降低和升高的變化趨勢(shì)與在起始細(xì)胞未進(jìn)行細(xì)胞周期同步化的情況下類似(圖3-B)。CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介導(dǎo)的編輯，其細(xì)胞存活率分別從8 h時(shí)間點(diǎn)的11.1‰和9.9‰逐漸下降到36 h時(shí)間點(diǎn)的4.2‰和0.8‰，分別下降了3倍和12倍；而編輯突變率分別從12 h時(shí)間點(diǎn)的0.74‰和0.09‰升高到36 h時(shí)間點(diǎn)的13.4‰和1.6‰，均約升高了18倍(圖3-B)。與CRISPR/Cas9編輯相比，CRISPR/Cpf1編輯的細(xì)胞存活率和突變率均較低，表明細(xì)胞對(duì)CRISPR/Cpf1編輯產(chǎn)生的5′2–4-nt粘性末端DSB的易錯(cuò)修復(fù)能力可能低于對(duì)CRISPR/Cas9編輯產(chǎn)生的平末端或低頻率的5′1-nt DSB的易錯(cuò)修復(fù)。另外，對(duì)于同一種編輯工具編輯相同的時(shí)間而言，經(jīng)α-因子細(xì)胞周期同步化的細(xì)胞的存活率和突變率均低于未經(jīng)同步化的細(xì)胞。NHEJ作為一種在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)進(jìn)行的DSB修復(fù)途徑，在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)都能發(fā)揮作用，且主要發(fā)生在G1期[26]，但是將細(xì)胞周期同步化至condition grown in glucose media(right panel);D:The maximum cell growth rate(μmax)of synchronized and unsynchronized cells.Cells were cultured with glucose(left panel,unediting)and galactose(right panel,editing).The parameter ofμmax was calculated corresponding to the fermentation profiles using Originlab?Origin 8.The strains were listed in Table 1.Data represent the mean and standard error of duplicate cultures at each condition.圖3.未同步化和α-因子同步化細(xì)胞的基因組編輯效果評(píng)價(jià)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]釀酒酵母形態(tài)變化檢驗(yàn)點(diǎn)的研究進(jìn)展[J]. 祝嫦巍,史鈞.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(05)



本文編號(hào)：3268411