可有效提高鏈霉菌內源抗生素產量的“超級質粒”的構建及應用
發(fā)布時間：2021-07-04 06:26
微生物可產生豐富的次級代謝產物,這些產物在化學結構及生物活性方面具有豐富的多樣性。其中以鏈霉菌為代表的放線菌,所產生的抗生素類活性產物占已知抗生素種類的70%以上。大多數野生型鏈霉菌抗生素的產量較低,無法滿足工業(yè)化需求。本研究選擇了將全局性調控因子afs R、環(huán)化腺苷酸受體蛋白基因crp、引入點突變的RNA聚合酶β亞基的編碼基因（rpo B）及乙酰輔酶A羧化酶基因（acc A2BE）這四個具有顯著上調鏈霉菌抗生素產量的元件,一起克隆到組成型強啟動子Perm E*的下游,通過鏈霉菌整合型載體p SET152,將這些基因元件引入到不同的抗生素產生菌中進行超量表達,以期提高抗生素的產量。將構建好的“超級質�！睂隨treptomyces coelicolor M145中,將聚酮類化合物放線紫紅素的產量提高到了野生型的2.019倍,十一烷基靈菌紅素的產量提高到了野生型的2.816倍;導入吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus ATCC29253,將安莎類抗生素hygrocin A的產量提高到了野生型的2.634倍,雷帕霉素的產...
【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數】：129 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
基因表達多層次調控圖(LeeYJ2018)
華中農業(yè)大學2020屆博士研究生學位（畢業(yè)）論文6圖1.2多效調節(jié)基因adpA的調節(jié)模型(Liuetal.2013)Figure1.2RegulationmodelofthepleiotropicregulatorygeneadpAS.lividans體內的Reg1，其N-末端含有一個螺旋-轉角-螺旋的DNA結合位點。該蛋白分子與S.coelicolor中malE基因的抑制因子MalR具有95%的相似性；與S.limosus中α-淀粉酶的正向調控因子ORF-Sl的相似性為65%；同時也與Bacillussubtilis中碳代謝的抑制因子CcpA具有31%的相似性。在S.lividans中其能夠影響α-淀粉酶的產量，同時還能夠消除碳分解代謝過程中的抑制作用(Nguyenetal.1997)。降解物激活蛋白-環(huán)腺苷酸受體蛋白基因crp(cyclicadenosinemonophosphatereceptorprotein,CRP)也是一種全局性轉錄調控因子(Derouauxetal.2004;Espertetal.2011)。最初是在Escherichiacoli中發(fā)現(xiàn)的該調控因子，與其效應分子cAMP一起介導大腸桿菌中的碳代謝(Yanetal.2015)。Crp調控因子介導于鏈霉菌的初級和次級代謝過程中(Derouauxetal.2004;Pietteetal.2005;Gaoetal.2012)。Crp可以為次級代謝提供前體物質和輔助因子，還能促進生物合成基因簇表達增加，從而直接或間接控制次級代謝。此外，tarA(Engeletal.2001)、crpA(Onakaetal.1998)和spbR(Folcheretal.2001)等都屬于鏈霉菌體內的多效調節(jié)因子。
華中農業(yè)大學2020屆博士研究生學位（畢業(yè)）論文8環(huán)境中的信號與含有α-螺旋的感應因子的N-末端相結合，在ATP的幫助下，磷酸化的激酶蛋白將感應因子的組氨基酸殘基磷酸化，導致相應的構象發(fā)生變化。隨后應答調節(jié)蛋白N末端上的氨基酸殘基會接收到磷酸化的激酶蛋白提供的磷�；罱K使應答調節(jié)蛋白發(fā)生磷酸化而活化，當被磷酸化的應答因子結合到靶基因的啟動子上，最終使目標基因的轉錄被抑制或者激活。。圖1.3典型的雙組份系統(tǒng)的信號傳導模式圖(Hoch2000)Figure1.3Signalingpatterndiagramofatypicaltwo-componentsystem原核生物體內普遍存在著雙組分調控體系，這也是生物細胞中最常見的信號轉導途徑之一。該系統(tǒng)控制著生物類群細菌的趨化性、孢子的形成、滲透壓和次級代謝物質的合成等大多數生理過程。雙組分調控系統(tǒng)（TCSs）在鏈霉菌中存在著兩種能夠調控次級代謝產物的激酶超家族：一種是絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶家族，這類家族通過級聯(lián)效應來影響鏈霉菌的次級代謝，例如外部環(huán)境引起的蛋白激酶的磷酸化和脫磷酸化；另一種類型是組氨酸激酶家族，這一類家族由兩個蛋白組成，一個是磷酸化供體-組氨酸激酶蛋白（HK），跨膜蛋白HK由感應域、發(fā)送域和ATP酶域三個功能結構域組成。另一種是磷酸化受體-應答調節(jié)蛋白（RR），RRs含有兩個區(qū)域：接收區(qū)和效應區(qū)，屬于這一類家族的調控系統(tǒng)如：cutR/cutS(Tanakaetal.2007)、afsQ1/afsQ2(Ishizukaetal.1992)、ecrA1/ecrA2(Huangetal.2001)等。AfsR/afsK是鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的第一個真核類的雙組份調控系統(tǒng)(Umeyamaetal.2002)，屬于典型的絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶家族(Tanakaetal.2007)。其調控機制如下圖所示（圖1.4）(Horinouchi2003)，AfsK是一種蛋白激酶，其與膜的內側相
【參考文獻】：
期刊論文
[1]龜裂鏈霉菌M527接合轉移體系的建立和優(yōu)化以及啟動子的活性分析（英文）[J]. Zhang-qing SONG,Zhi-jun LIAO,Ye-feng HU,Zheng MA,Andreas BECHTHOLD,Xiao-ping YU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2019(11)
[2]Comparative analysis of rapamycin biosynthesis clusters between Actinoplanes sp. N902-109 and Streptomyces hygroscopicus ATCC29253[J]. HUANG He,REN Shuang-Xi,YANG Sheng,HU Hai-Feng. Chinese Journal of Natural Medicines. 2015(02)
[3]鏈霉菌負調控因子突變篩選系統(tǒng)的構建[J]. 朱宇,馮遲,譚華榮,田宇清. 微生物學報. 2013(10)
[4]luxAB發(fā)光基因標記的銅綠假單胞菌株的構建[J]. 李聞,劉紅艷,黃正. 衛(wèi)生研究. 2011(01)
本文編號：3264228
【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數】：129 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
基因表達多層次調控圖(LeeYJ2018)
華中農業(yè)大學2020屆博士研究生學位（畢業(yè)）論文6圖1.2多效調節(jié)基因adpA的調節(jié)模型(Liuetal.2013)Figure1.2RegulationmodelofthepleiotropicregulatorygeneadpAS.lividans體內的Reg1，其N-末端含有一個螺旋-轉角-螺旋的DNA結合位點。該蛋白分子與S.coelicolor中malE基因的抑制因子MalR具有95%的相似性；與S.limosus中α-淀粉酶的正向調控因子ORF-Sl的相似性為65%；同時也與Bacillussubtilis中碳代謝的抑制因子CcpA具有31%的相似性。在S.lividans中其能夠影響α-淀粉酶的產量，同時還能夠消除碳分解代謝過程中的抑制作用(Nguyenetal.1997)。降解物激活蛋白-環(huán)腺苷酸受體蛋白基因crp(cyclicadenosinemonophosphatereceptorprotein,CRP)也是一種全局性轉錄調控因子(Derouauxetal.2004;Espertetal.2011)。最初是在Escherichiacoli中發(fā)現(xiàn)的該調控因子，與其效應分子cAMP一起介導大腸桿菌中的碳代謝(Yanetal.2015)。Crp調控因子介導于鏈霉菌的初級和次級代謝過程中(Derouauxetal.2004;Pietteetal.2005;Gaoetal.2012)。Crp可以為次級代謝提供前體物質和輔助因子，還能促進生物合成基因簇表達增加，從而直接或間接控制次級代謝。此外，tarA(Engeletal.2001)、crpA(Onakaetal.1998)和spbR(Folcheretal.2001)等都屬于鏈霉菌體內的多效調節(jié)因子。
華中農業(yè)大學2020屆博士研究生學位（畢業(yè)）論文8環(huán)境中的信號與含有α-螺旋的感應因子的N-末端相結合，在ATP的幫助下，磷酸化的激酶蛋白將感應因子的組氨基酸殘基磷酸化，導致相應的構象發(fā)生變化。隨后應答調節(jié)蛋白N末端上的氨基酸殘基會接收到磷酸化的激酶蛋白提供的磷�；罱K使應答調節(jié)蛋白發(fā)生磷酸化而活化，當被磷酸化的應答因子結合到靶基因的啟動子上，最終使目標基因的轉錄被抑制或者激活。。圖1.3典型的雙組份系統(tǒng)的信號傳導模式圖(Hoch2000)Figure1.3Signalingpatterndiagramofatypicaltwo-componentsystem原核生物體內普遍存在著雙組分調控體系，這也是生物細胞中最常見的信號轉導途徑之一。該系統(tǒng)控制著生物類群細菌的趨化性、孢子的形成、滲透壓和次級代謝物質的合成等大多數生理過程。雙組分調控系統(tǒng)（TCSs）在鏈霉菌中存在著兩種能夠調控次級代謝產物的激酶超家族：一種是絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶家族，這類家族通過級聯(lián)效應來影響鏈霉菌的次級代謝，例如外部環(huán)境引起的蛋白激酶的磷酸化和脫磷酸化；另一種類型是組氨酸激酶家族，這一類家族由兩個蛋白組成，一個是磷酸化供體-組氨酸激酶蛋白（HK），跨膜蛋白HK由感應域、發(fā)送域和ATP酶域三個功能結構域組成。另一種是磷酸化受體-應答調節(jié)蛋白（RR），RRs含有兩個區(qū)域：接收區(qū)和效應區(qū)，屬于這一類家族的調控系統(tǒng)如：cutR/cutS(Tanakaetal.2007)、afsQ1/afsQ2(Ishizukaetal.1992)、ecrA1/ecrA2(Huangetal.2001)等。AfsR/afsK是鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的第一個真核類的雙組份調控系統(tǒng)(Umeyamaetal.2002)，屬于典型的絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶家族(Tanakaetal.2007)。其調控機制如下圖所示（圖1.4）(Horinouchi2003)，AfsK是一種蛋白激酶，其與膜的內側相
【參考文獻】：
期刊論文
[1]龜裂鏈霉菌M527接合轉移體系的建立和優(yōu)化以及啟動子的活性分析（英文）[J]. Zhang-qing SONG,Zhi-jun LIAO,Ye-feng HU,Zheng MA,Andreas BECHTHOLD,Xiao-ping YU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2019(11)
[2]Comparative analysis of rapamycin biosynthesis clusters between Actinoplanes sp. N902-109 and Streptomyces hygroscopicus ATCC29253[J]. HUANG He,REN Shuang-Xi,YANG Sheng,HU Hai-Feng. Chinese Journal of Natural Medicines. 2015(02)
[3]鏈霉菌負調控因子突變篩選系統(tǒng)的構建[J]. 朱宇,馮遲,譚華榮,田宇清. 微生物學報. 2013(10)
[4]luxAB發(fā)光基因標記的銅綠假單胞菌株的構建[J]. 李聞,劉紅艷,黃正. 衛(wèi)生研究. 2011(01)
本文編號：3264228
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