阿魏酸是植物中廣泛存在的酚類(lèi)化學(xué)物質(zhì),具有抗氧化活性.阿魏酸酯酶能夠水解植物細(xì)胞壁半纖維素和阿魏酸之間的酯鍵,釋放阿魏酸,在食品、醫(yī)藥、飼料加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值.馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）是一種生長(zhǎng)迅速、蛋白分泌能力強(qiáng)的新型食品安全級(jí)酵母,具有高效分泌表達(dá)菊粉酶的能力,本研究利用基因組菊粉酶位點(diǎn)INU1整合與游離質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用的方式,在馬克斯克魯維酵母中實(shí)現(xiàn)了黑曲霉（Aspergillus niger）阿魏酸酯酶AnFaeA的高效表達(dá),發(fā)酵液上清中的酶活達(dá)到164.4U/mL.利用馬克斯克魯維酵母重組表達(dá)的阿魏酸酯酶能夠高效降解玉米芯釋放阿魏酸,釋放量可達(dá)1.81mg/g,并且在β-木聚糖酶的協(xié)助下可進(jìn)一步提高阿魏酸的釋放量,達(dá)到2.8mg/g. 

【文章來(lái)源】：復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,59(05)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

阿魏酸酯酶基因AnfaeA在K.marxianus菊粉酶基因位點(diǎn)INU1的整合

將基因組整合菌株FIM-1(ura3Δ）/inu∶∶AnfaeA、質(zhì)粒表達(dá)菌株FIM-1/pUKDN132-AnfaeA和基因組整合與質(zhì)粒共表達(dá)菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA分別接種于50mL YD培養(yǎng)基中，在30℃下?lián)u床培養(yǎng)72h后檢測(cè)上清中阿魏酸酯酶的酶活（圖2(a））．整合表達(dá)菌株的分泌表達(dá)阿魏酸酯酶最低，上清中酶活為0.23U/mL，質(zhì)粒表達(dá)菌株的阿魏酸酯酶表達(dá)量是整合表達(dá)菌株的2.2倍，上清中阿魏酸酯酶酶活為0.51U/mL，而基因組整合與質(zhì)粒共表達(dá)菌株的阿魏酸酯酶表達(dá)量最高，酶活達(dá)到0.76U/mL，分別是基因組整合表達(dá)菌株和質(zhì)粒表達(dá)菌株的3.3倍和1.5倍．發(fā)酵上清的SDS-PAGE檢測(cè)也表明，基因組整合與質(zhì)粒共表達(dá)菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA分泌表達(dá)的阿魏酸酯酶產(chǎn)量最高（圖2(b）），結(jié)果說(shuō)明在質(zhì)粒表達(dá)的基礎(chǔ)上通過(guò)在基因組中整合表達(dá)AnfaeA可以顯著提高阿魏酸酯酶的表達(dá)水平．進(jìn)一步在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行3株重組表達(dá)菌株的阿魏酸酯酶產(chǎn)酶能力分析，結(jié)果如圖3所示．質(zhì)粒表達(dá)菌株FIM-1/pUKDN132-AnfaeA和基因組整合與質(zhì)粒共表達(dá)菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA在發(fā)酵72h后細(xì)胞密度（OD600）約560，而基因組整合表達(dá)菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA發(fā)酵72h后的細(xì)胞密度（OD600）約500，這可能與菌株的生長(zhǎng)速率較慢和種子液的狀態(tài)有關(guān)（圖3(a））．發(fā)酵罐發(fā)酵72h后3種菌株的阿魏酸酯酶產(chǎn)量達(dá)到峰值，質(zhì)粒表達(dá)菌株和基因組整合表達(dá)菌株的酶活分別為131.3U/mL和7.7U/mL，而基因組整合與質(zhì)粒共表達(dá)菌株的阿魏酸酯酶產(chǎn)量最高，上清中的酶活可達(dá)164.4U/mL（圖3(b）），分別是前兩株菌株產(chǎn)量的1.25倍和21.4倍．發(fā)酵液上清的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組整合表達(dá)菌株發(fā)酵48h才能檢測(cè)到阿魏酸酯酶蛋白的積累，而質(zhì)粒表達(dá)菌株和基因組整合與質(zhì)粒共表達(dá)菌株在發(fā)酵24h時(shí)就能夠檢測(cè)到阿魏酸酯酶蛋白的積累，該結(jié)果可能與基因組整合表達(dá)菌株前期細(xì)胞密度增加較慢有關(guān)．此外，由于基因組整合表達(dá)菌株和基因組整合與質(zhì)粒共表達(dá)菌株中的菊粉酶基因被阿魏酸酯酶基因所置換，因此在它們的發(fā)酵上清沒(méi)有檢測(cè)到大小約95～130kDa的菊粉酶蛋白條帶．

在測(cè)試重組阿魏酸酯酶對(duì)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的降解效果前，我們檢測(cè)了常見(jiàn)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品麥麩、玉米皮、米糠、豆粕和玉米芯中的阿魏酸含量，發(fā)現(xiàn)玉米芯的阿魏酸含量最高，為18.8mg/g，為豆粕含量的78倍（圖6(a）），因此選用玉米芯作為阿魏酸酯酶水解的底物．含有2g玉米芯的50mL反應(yīng)體系中加入2U阿魏酸酯酶發(fā)酵液降解玉米芯24h，重組阿魏酸酯酶可以從玉米芯中釋放出1.81mg/g阿魏酸，加入200Uβ-木聚糖酶能夠從玉米芯中釋放0.81mg/g阿魏酸，而同時(shí)加入2U阿魏酸酯酶和200Uβ-木聚糖酶，阿魏酸釋放量可達(dá)2.8mg/g，較阿魏酸酯酶單酶水解的釋放量提高了55%（圖6(b）），說(shuō)明K.marxianus重組表達(dá)的阿魏酸酯酶可以與β-木聚糖酶協(xié)同作用，酶降解玉米芯釋放阿魏酸．

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]堿性果膠酶高產(chǎn)菌株的構(gòu)建和高密度發(fā)酵[J]. 望瀟文,向臘,徐婷,盧爭(zhēng)輝,張桂敏.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(12)
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[3]黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J]. 周燕燕,劉新利,陳靜,胡泓宇,侯運(yùn)華.  微生物學(xué)報(bào). 2014(08)
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