發(fā)布時間：2021-06-19 15:49

　　目的原核表達(dá)、純化一種銅鋅超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD）突變體,并檢測其酶活性。方法將經(jīng)熱力學(xué)優(yōu)化的Cu,Zn-SOD突變體基因亞克隆至pET-28a載體中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒SOD1-pET-28a,轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3）中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá);在500 mL搖瓶培養(yǎng)條件下,通過改變加入Cu、Zn離子的量優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件;表達(dá)的重組蛋白經(jīng)初步純化后,測定酶活性。結(jié)果重組表達(dá)質(zhì)粒SOD-pET-28a經(jīng)雙酶切及測序證明構(gòu)建正確;表達(dá)的重組蛋白相對分子質(zhì)量約為15 000,主要以可溶性形式表達(dá);工程菌株在500 mL搖瓶培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至10 h左右,A₆₀₀至3. 5左右時加入終濃度為0. 1 mmol/L IPTG、0. 2 mmol/L ZnCl₂、0. 5 mmol/L CuSO4,可獲得最佳表達(dá)量（29. 2%）;初步純化獲得的重組蛋白純度為97. 32%,比活為5. 08×103U/mg。結(jié)論成功利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了一種經(jīng)熱力學(xué)優(yōu)化的Cu,Zn-SOD突變體,初步純化的突變體具有較好的酶活性,為進(jìn)一步摸索大規(guī)模生... 

【文章來源】：中國生物制品學(xué)雜志. 2020,33(06)CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

Cu,Zn-SOD突變體基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

重組表達(dá)質(zhì)粒SOD1-pET-28a的雙酶切（NdeⅠ/HindⅢ）產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約500 bp的目的基因片段，見圖2。經(jīng)測序及BLAST分析，片段大小與目的片段核苷酸序列一致，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]老年血管性癡呆患者認(rèn)知功能與血清Hcy和SOD水平的關(guān)系[J]. 謝先龍,吳艷霞,吳婷玉,吳儇,王巍.  中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志. 2018(14)
[2]非酶促糖基化SOD對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠的降血糖作用[J]. 趙丹,蔡麗萍,傅婷,張海玲,劉樹滔,饒平凡.  中國食品學(xué)報. 2018(06)
[3]細(xì)胞外超氧化物歧化酶DNA甲基化對動脈粥樣硬化的誘導(dǎo)作用及作用靶點(diǎn)[J]. 陳佳,楊曉龍,張旭峰.  中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志. 2018(10)
[4]表達(dá)人源SOD的畢赤酵母重組子的構(gòu)建[J]. 李新鳴,孫冶,肖純凌.  中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2017(12)
[5]番茄超氧化物歧化酶的生物信息學(xué)分析[J]. 郭笑,苑廣信,王曼力,趙南晰,李洪宇,安麗萍.  北方園藝. 2016(21)
[6]異亮氨酸熱分解機(jī)理的PM3研究[J]. 胡立新,陳曉耘.  湖北工學(xué)院學(xué)報. 2000(02)

碩士論文
[1]基于分子動力學(xué)分析的Mn-SOD的熱穩(wěn)定性研究[D]. 魏貝貝.曲阜師范大學(xué) 2018



本文編號：3238097