肝素酶Ⅰ（Hep Ⅰ）是一種可以特異性將肝素降解為低聚糖或不飽和二糖的多糖裂解酶,可用于低分子量肝素的制備,體外循環(huán)中肝素的消除以及肝素精確結(jié)構(gòu)的確定。本文選擇了三種不同來(lái)源的肝素酶I,構(gòu)建可溶性表達(dá)肝素酶I的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),制備了三種重組肝素酶I,對(duì)其表達(dá)過(guò)程和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,并對(duì)肝素酶I與底物肝素的作用方式進(jìn)行了初步探索,主要研究?jī)?nèi)容包括:1)選擇來(lái)源于Bacteroides eggerthii VPI T5-42B-1、Bacteroides xylanisolvens SDCC 2a和Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的三種肝素酶I,分別命名為BeHep Ⅰ、BxHep Ⅰ和BcHep Ⅰ,各自編碼394、381和389個(gè)氨基酸殘基。成功構(gòu)建了三種pET-28a-Hep Ⅰ表達(dá)載體,通過(guò)E.coli BL21（DE3）表達(dá)可溶性肝素酶I。2)對(duì)三種重組肝素酶Ⅰ進(jìn)行表達(dá)研究。誘導(dǎo)BeHep Ⅰ的最適IPTG濃度為0.1mM,溫度為30℃,誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為6 h,得到的粗酶活力為5038 U·L^-1。經(jīng)鎳柱親和純化后,得... 

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肝素酶I-III對(duì)肝素和硫酸乙酰肝素的裂解Fig.1.1DegradationofheparinandheparinsulfatebyheparinasesI-III

三種肝素酶I的克隆表達(dá)及性質(zhì)研究202.2結(jié)果與討論2.2.1B.eggerthiiVPIT5-42B-1肝素酶I序列分析圖2.2BeHepI與其他三種肝素酶I序列比對(duì)Fig.2.2.MultiplesequencealignmentofheparinasesfromB.eggerthii(BeHepI),F.heparinum(FhHepI),B.thetaiotaomicron(BtHepI)andB.stercoris(BsHepI)從PIR（https://proteininformationresource.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載來(lái)源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的HepI基因序列，利用Clustal-W[68]在線服務(wù)器對(duì)BeHepI的氨基酸序列與其他同源物進(jìn)行比較，對(duì)肝素酶I的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行分析，并使用ESPript進(jìn)行作圖[69]。來(lái)源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的肝素酶I基因長(zhǎng)度為1182bp，編碼394個(gè)氨基酸，其中1~22個(gè)氨基酸屬于信號(hào)肽序列。BeHepI的理論分子量為44.56kDa，等電點(diǎn)為9.55，切除信號(hào)肽后的蛋白理論分子量為42.23kDa。圖2.2結(jié)果顯示BeHepI的蛋白序列與FhHepI、BtHepI和BsHepI的蛋白序列一致性分別為62.4%、81.5%和89.3%。FhHepI的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸Cys135、His203和Lys199（分別用▲、和標(biāo)注）在BeHepI中是高度保守的。Cys135是FhHepI在裂

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文21解肝素過(guò)程中重要的親核氨基酸[31]。His203是激活FhHepI通過(guò)β-消除反應(yīng)催化底物肝素的關(guān)鍵氨基酸殘基，Lys199是FhHepI中兩個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)之一，對(duì)于維持肝素酶I的催化活性有重要意義[70]。推測(cè)這三個(gè)氨基酸殘基在BeHepI的催化過(guò)程中同樣發(fā)揮重要的作用。2.2.2重組HepI表達(dá)載體的構(gòu)建為了驗(yàn)證HepI基因是否與pET-28a載體連接成功，使用BamHI和HindIII兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)連接得到的載體進(jìn)行處理，如圖2.3瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)了兩個(gè)所在位置與理論值相符的條帶，分別對(duì)應(yīng)于pET-28a質(zhì)粒（5369bp）和HepI目的基因片段（1128bp），驗(yàn)證了pET-28a-HepI表達(dá)載體連接成功。為了確保重組質(zhì)粒沒(méi)有出現(xiàn)單點(diǎn)或多點(diǎn)突變，對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中BeHepI序列一致，說(shuō)明pET-28a-HepI表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖2.3pET-28a-HepI表達(dá)載體雙酶切實(shí)驗(yàn)（M：DNAladder；1：雙酶切產(chǎn)物）Fig.2.3DoubledigestionreactionofpET-28a-HepI(M:DNAladder,1:productionofthedoubledigestionreaction)2.2.3重組HepI表達(dá)條件的優(yōu)化2.2.3.1IPTG濃度對(duì)HepI活力的影響IPTG不會(huì)被菌體代謝因而作為乳糖的替代品用于外源蛋白的表達(dá)，IPTG在誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)時(shí)受其濃度的影響，而且會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生抑制作用[71]。因而使用適宜濃度的IPTG對(duì)HepI進(jìn)行誘導(dǎo)至關(guān)重要。圖2.4.1為IPTG濃度對(duì)HepI粗


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