RBM47磷酸化在心臟再生中的分子機制
發(fā)布時間：2021-05-31 22:33
心臟再生是一個復(fù)雜而精密的過程,涉及細胞的增殖、分化與組織形態(tài)的重建,RNA結(jié)合蛋白（RBP）在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。RBM47是一種RNA結(jié)合蛋白,具有調(diào)控mRNA可變剪接、堿基編輯和多聚腺苷化的作用,在早期神經(jīng)發(fā)育和腫瘤發(fā)展中有顯著功能。我們發(fā)現(xiàn)RBM47在新生小鼠和成年斑馬魚的心臟損傷中表達上調(diào),且存在二聚體與剪切體的形式。推測RBM47二聚化和剪切體形成與蛋白翻譯后修飾有關(guān),我們應(yīng)用親和質(zhì)譜技術(shù)鑒定了RBM47的磷酸化位點。其中位于RBM47RNA結(jié)合域中的S309位點磷酸化受心臟損傷激活,T314位點磷酸化水平在心臟損傷中被抑制。推測RBM47S309位點磷酸化參與心臟再生過程。我們發(fā)現(xiàn)RBM47S309位點的上游磷酸激酶是GRK2,GRK2可能介導(dǎo)RBM47對外界壓力的響應(yīng),其中RBM47S309與T314位點磷酸化均能被低氧激活（1%O2）,精神壓力可能抑制RBM47S309與T314位點磷酸化。綜上所述,我們的研究以RBM47磷酸化為切入點,討論了RBM47磷酸化與二聚體、剪切體之間的關(guān)系,探究蛋白激酶調(diào)節(jié)下RBM47磷酸化在心臟再生中的作用。
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：79 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
GRK2在一般條件下存在與細胞質(zhì)中，在GPCR活化時，GRK2通過與定位在膜上的Gbc結(jié)合而易位至細胞膜膜
圖 3 RBM47 二聚體與剪切體的分布Fig. 3 Distribution of RBM47 dimer and splicingRBM47 二聚體與剪切體的分布情況。RBM47 在細胞中存在三種表達構(gòu)型，可以被 western 的構(gòu)型分別處在 130 KD、72 KD 和 34 KD 的位置，我們推測 RBM47 潛在的翻譯后修飾與之理能夠抑制 RBM47 在 130 KD、72 KD 和 34 KD 處的表達分布。分別將靶向 RBM47 的 siRNA 時轉(zhuǎn)染到 HCT116 細胞中， 72 小時后，提取蛋白用以 Western Blot 實驗，用 RBM47 和 AD、72 KD 和 34 KD 處為特異條帶，二聚體（130 KDa）與剪切體（34 KDa）均能被 siRNA淀實驗驗證 RBM47 在細胞中的三種存在形式。將生長旺盛的 HCT116 細胞用細胞裂解液裂抗體進行免疫共沉淀反應(yīng)。將免疫共沉淀反應(yīng)復(fù)合體進行 western blot，用 RBM47 抗體檢與剪切體三種形式都存在。C）外源表達的 RBM47 蛋白在細胞內(nèi)除 72 KD 條帶外，34 KDa 檢測到。將帶有 Flag 標簽的 RBM47 蛋白超量表達于 HCT116 細胞中，24 小時后收集細胞裂lot，用 Flag 抗體，RBM47 抗體和 Actin 抗體檢測。（與其他同學(xué)合作）。3 Distribution of RBM47 dimer and splicing. There are three configurations of RBM47 in cells, wd by western bolt as specific signal at 130KD, 72KD and 34KD. We speculate that thlational modification of RBM47 is related to it. A) SiRNA treatment can inhibit three configoth siRNA targeting the RBM47 and Scramble siRNA were transiently transfected into HCT116
圖 4 RBM47 二聚體與剪切體的動態(tài)變化Fig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. 4 RBM47 二聚體與剪切體的動態(tài)變化。A）DTT 處理后，斑馬魚樣品 95 KDa 以上的條帶消失，小鼠樣 KDa 處條帶信號減弱。將組織樣品取出 30 μL 加入 0.3 μL DTT（終濃度保持在 10mM），室溫處理 30 min；入 7.5 μLIODO（終濃度維持在 100mM），避光室溫處理 1 h。將處理后的樣品以 RBM47 抗體進行 westeB）斑馬魚 95 KDa 處條帶信號重新出現(xiàn)，小鼠樣品的 55 KDa 處信號增強，而 95KDa 處信號消失。2 天DTT 樣品再次檢測。C）細胞樣品沒有顯著變化。用 DTT 對細胞樣品處理，以 RBM47 抗體進行 westeD）半胱氨酸全突變后，RBM47 在 130 KDa 處信號消失，34 KDa 處信號減弱。構(gòu)建了 RBM47-CtoA 的達載體，將半胱氨酸全部突變?yōu)楸彼�，并與 RBM47-WT 超量表達載體一同轉(zhuǎn)染 HCT116 細胞。ig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. A) After DTT treatment, the band above 95 KDa of thish samples was disappeared, and the signal at 95 KDa of the mouse samples was attenuated. Tissue samples（3were added to 0.3 μL TT (final concentration 10 mM), treated at room temperature for 30 min; then added 7.5 μ (final concentration 100 mM) was, and treated at room temperature for 1 h （Protected from light）. The DT samples were subjected to western blot analysis with antibody against RBM47. B) The signal at the 95KDa ish reappeared, the signal at 55KDa in the mouse sample was enhanced, and the signal at 95KDa disappeare
本文編號：3209098
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：79 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
GRK2在一般條件下存在與細胞質(zhì)中，在GPCR活化時，GRK2通過與定位在膜上的Gbc結(jié)合而易位至細胞膜膜
圖 3 RBM47 二聚體與剪切體的分布Fig. 3 Distribution of RBM47 dimer and splicingRBM47 二聚體與剪切體的分布情況。RBM47 在細胞中存在三種表達構(gòu)型，可以被 western 的構(gòu)型分別處在 130 KD、72 KD 和 34 KD 的位置，我們推測 RBM47 潛在的翻譯后修飾與之理能夠抑制 RBM47 在 130 KD、72 KD 和 34 KD 處的表達分布。分別將靶向 RBM47 的 siRNA 時轉(zhuǎn)染到 HCT116 細胞中， 72 小時后，提取蛋白用以 Western Blot 實驗，用 RBM47 和 AD、72 KD 和 34 KD 處為特異條帶，二聚體（130 KDa）與剪切體（34 KDa）均能被 siRNA淀實驗驗證 RBM47 在細胞中的三種存在形式。將生長旺盛的 HCT116 細胞用細胞裂解液裂抗體進行免疫共沉淀反應(yīng)。將免疫共沉淀反應(yīng)復(fù)合體進行 western blot，用 RBM47 抗體檢與剪切體三種形式都存在。C）外源表達的 RBM47 蛋白在細胞內(nèi)除 72 KD 條帶外，34 KDa 檢測到。將帶有 Flag 標簽的 RBM47 蛋白超量表達于 HCT116 細胞中，24 小時后收集細胞裂lot，用 Flag 抗體，RBM47 抗體和 Actin 抗體檢測。（與其他同學(xué)合作）。3 Distribution of RBM47 dimer and splicing. There are three configurations of RBM47 in cells, wd by western bolt as specific signal at 130KD, 72KD and 34KD. We speculate that thlational modification of RBM47 is related to it. A) SiRNA treatment can inhibit three configoth siRNA targeting the RBM47 and Scramble siRNA were transiently transfected into HCT116
圖 4 RBM47 二聚體與剪切體的動態(tài)變化Fig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. 4 RBM47 二聚體與剪切體的動態(tài)變化。A）DTT 處理后，斑馬魚樣品 95 KDa 以上的條帶消失，小鼠樣 KDa 處條帶信號減弱。將組織樣品取出 30 μL 加入 0.3 μL DTT（終濃度保持在 10mM），室溫處理 30 min；入 7.5 μLIODO（終濃度維持在 100mM），避光室溫處理 1 h。將處理后的樣品以 RBM47 抗體進行 westeB）斑馬魚 95 KDa 處條帶信號重新出現(xiàn)，小鼠樣品的 55 KDa 處信號增強，而 95KDa 處信號消失。2 天DTT 樣品再次檢測。C）細胞樣品沒有顯著變化。用 DTT 對細胞樣品處理，以 RBM47 抗體進行 westeD）半胱氨酸全突變后，RBM47 在 130 KDa 處信號消失，34 KDa 處信號減弱。構(gòu)建了 RBM47-CtoA 的達載體，將半胱氨酸全部突變?yōu)楸彼�，并與 RBM47-WT 超量表達載體一同轉(zhuǎn)染 HCT116 細胞。ig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. A) After DTT treatment, the band above 95 KDa of thish samples was disappeared, and the signal at 95 KDa of the mouse samples was attenuated. Tissue samples（3were added to 0.3 μL TT (final concentration 10 mM), treated at room temperature for 30 min; then added 7.5 μ (final concentration 100 mM) was, and treated at room temperature for 1 h （Protected from light）. The DT samples were subjected to western blot analysis with antibody against RBM47. B) The signal at the 95KDa ish reappeared, the signal at 55KDa in the mouse sample was enhanced, and the signal at 95KDa disappeare
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