睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）是一種能夠降解類固醇的革蘭氏陰性細(xì)菌,其代謝過(guò)程有20幾種酶共同參與,近年關(guān)于睪丸酮叢毛單胞菌的生物修復(fù)作用及酶基因表達(dá)調(diào)控成為很多學(xué)者關(guān)注熱點(diǎn)。SDRx短鏈脫氫酶是睪丸酮叢毛單胞菌中一種重要的激素降解酶。本文通過(guò)重組質(zhì)粒的構(gòu)建、酶聯(lián)免疫吸附、高效液相色譜、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化等方法研究睪丸酮叢毛單胞菌中三種調(diào)控蛋白（LysR、LuxR、TetR）對(duì)SDR的生物學(xué)作用。通過(guò)構(gòu)建SDRx基因蛋白表達(dá)載體;利用大腸桿菌BL21（DE3）plysS菌株進(jìn)行原核表達(dá)并純化目的蛋白;利用純化的蛋白制備小鼠多克隆抗體,利用ELISA的檢測(cè)方法測(cè)定抗體效價(jià)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;利用基因同源重組及移碼突變的原理構(gòu)建睪丸酮叢毛單胞菌SDRx基因敲除突變株,并利用HPLC檢測(cè)其在五種不同激素培養(yǎng)條件下,LB培養(yǎng)基中所剩余激素含量;將含有三種調(diào)控蛋白的重組質(zhì)粒與含有107啟動(dòng)子的SDRx重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到HB101菌株中,加激素誘導(dǎo)并提取共轉(zhuǎn)化菌株總蛋白,利用ELISA的方法檢測(cè)共轉(zhuǎn)化菌株中SDRx的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:成功克隆了SDRx基因并表達(dá)及純化了SD... 

【文章來(lái)源】：長(zhǎng)春理工大學(xué)吉林省

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
    1.3 研究目的及意義
    1.4 研究方案
第二章 SDRx脫氫酶基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 儀器及藥品
        2.1.3 試劑及溶液
    2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
        2.2.1 睪丸酮叢毛單胞菌菌種復(fù)蘇
        2.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.2.3 睪丸酮叢毛單胞菌基因組DNA的提取
        2.2.4 睪丸酮叢毛單胞菌中SDRx基因的克隆
        2.2.5 pMD18-T-SDRx重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.6 pET-15b-SDRx重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 目的基因的獲取
        2.3.2 連接pMD18-T載體鑒定
        2.3.3 pMD18-T-SDRx重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
        2.3.4 pET-15b-SDRx重組質(zhì)粒鑒定
        2.3.5 pET-15b-SDRx重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
    2.4 結(jié)果討論
第三章 重組SDRx脫氫酶的表達(dá)及純化
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 主要儀器及藥品
        3.1.2 主要試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 SDRx重組蛋白的誘導(dǎo)及表達(dá)
        3.2.2 SDRx重組蛋白的純化及鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 重組載體p ET-15b-SDRx轉(zhuǎn)入表達(dá)菌種
        3.3.2 IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)
        3.3.3 蛋白含量檢測(cè)
    3.4 結(jié)果與討論
第四章 SDRx蛋白多克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 主要儀器及藥品
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 小鼠多克隆抗體的制備
        4.2.2 抗體效價(jià)的測(cè)定
        4.2.3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 多克隆抗體效價(jià)
        4.3.2 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
    4.4 結(jié)果討論
第五章 構(gòu)建SDRx敲除菌株并研究其生理活性
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 主要儀器
        5.1.2 主要試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        5.2.2 SDRx基因同源重組片段的PCR擴(kuò)增
        5.2.3 PCR產(chǎn)物的鑒定
        5.2.4 重組載體p MD18-T-SDRx300 的構(gòu)建
        5.2.5 重組載體p CR2.1-TOPO-SDR300 的構(gòu)建
        5.2.6 SDRx降解激素的功能表征
        5.2.7 LB培養(yǎng)基中甾體激素殘留量的HPLC分析
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 目的基因的獲取
        5.3.2 pCR2.1-TOPO-MSDRx重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.3.3 睪丸酮叢毛單胞菌SDRx敲除株P(guān)CR驗(yàn)證
        5.3.4 HPLC檢測(cè)甾體激素殘留量結(jié)果
    5.4 結(jié)果討論
第六章 三種蛋白對(duì)SDRx脫氫酶調(diào)控作用的研究
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
    6.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
        6.2.1 目的基因的克隆
        6.2.2 pMD18-T-107SDRx/LysR/TetR重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.2.3 pK18-107SDRx,pUC19-LysR/TetR重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.2.4 pK18-107SDRx分別與pUC19-LysR/LuxR/TetR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化
        6.2.5 共轉(zhuǎn)化菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及總蛋白的提取
        6.2.6 間接法ELISA檢測(cè)共轉(zhuǎn)化菌株總蛋白中SDRx脫氫酶含量
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 目的基因的獲取
        6.3.2 pMD18-T-TetR/LysR/107SDRx重組載體的鑒定
        6.3.3 pMD18-T-TetR/LysR/107SDRx雙酶切鑒定
        6.3.4 pK18-107SDRx,pUC19-LysR/LuxR/TetR重組質(zhì)粒鑒定
        6.3.5 測(cè)序結(jié)果
        6.3.6 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化及ELISA方法鑒定
    6.4 結(jié)果討論
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]LuxR家族調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)及功能[J]. 鄭世超,羅瑛,魯濤.  生命科學(xué). 2010(09)
[2]甾體雌激素的污染狀況與去除途徑[J]. 任海燕,紀(jì)樹(shù)蘭,崔成武,劉志鵬,王道,陳莎.  中國(guó)給水排水. 2004(12)
[3]甾體激素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系3AO增殖分化的影響[J]. 徐明娟,崔英,王昭梅,宋亮年.  上海醫(yī)學(xué). 2001(02)

博士論文
[1]睪丸酮叢毛單胞菌7α-羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)及調(diào)控分析[D]. 冀偉.吉林大學(xué) 2013
[2]睪丸酮叢毛單胞菌teiR基因功能及表達(dá)調(diào)控研究[D]. 陳建秋.福建農(nóng)林大學(xué) 2009

碩士論文
[1]睪丸酮叢毛單胞菌TetR對(duì)甾體類化合物水解酶3,17β-HSD和3α-HSD表達(dá)的調(diào)節(jié)[D]. 陳羚.長(zhǎng)春理工大學(xué) 2017
[2]睪丸酮叢毛單胞菌LysR基因?qū)?,17β-羥基類固醇脫氫酶的調(diào)控分析[D]. 李艷紅.長(zhǎng)春理工大學(xué) 2015
[3]睪丸酮叢毛單胞菌LysR基因的克隆、表達(dá)及對(duì)3α-HSD/CR的調(diào)控研究[D]. 于航.長(zhǎng)春理工大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3201555