睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）是一種能夠降解類固醇的革蘭氏陰性細菌,其代謝過程有20幾種酶共同參與,近年關于睪丸酮叢毛單胞菌的生物修復作用及酶基因表達調控成為很多學者關注熱點。SDRx短鏈脫氫酶是睪丸酮叢毛單胞菌中一種重要的激素降解酶。本文通過重組質粒的構建、酶聯(lián)免疫吸附、高效液相色譜、質粒共轉化等方法研究睪丸酮叢毛單胞菌中三種調控蛋白（LysR、LuxR、TetR）對SDR的生物學作用。通過構建SDRx基因蛋白表達載體;利用大腸桿菌BL21（DE3）plysS菌株進行原核表達并純化目的蛋白;利用純化的蛋白制備小鼠多克隆抗體,利用ELISA的檢測方法測定抗體效價并繪制標準曲線;利用基因同源重組及移碼突變的原理構建睪丸酮叢毛單胞菌SDRx基因敲除突變株,并利用HPLC檢測其在五種不同激素培養(yǎng)條件下,LB培養(yǎng)基中所剩余激素含量;將含有三種調控蛋白的重組質粒與含有107啟動子的SDRx重組質粒共轉化到HB101菌株中,加激素誘導并提取共轉化菌株總蛋白,利用ELISA的方法檢測共轉化菌株中SDRx的表達量。實驗結果表明:成功克隆了SDRx基因并表達及純化了SD... 

【文章來源】：長春理工大學吉林省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 國內外研究進展
    1.3 研究目的及意義
    1.4 研究方案
第二章 SDRx脫氫酶基因克隆及表達載體構建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 儀器及藥品
        2.1.3 試劑及溶液
    2.2 實驗內容
        2.2.1 睪丸酮叢毛單胞菌菌種復蘇
        2.2.2 引物的設計與合成
        2.2.3 睪丸酮叢毛單胞菌基因組DNA的提取
        2.2.4 睪丸酮叢毛單胞菌中SDRx基因的克隆
        2.2.5 pMD18-T-SDRx重組質粒的構建
        2.2.6 pET-15b-SDRx重組質粒的構建
    2.3 結果
        2.3.1 目的基因的獲取
        2.3.2 連接pMD18-T載體鑒定
        2.3.3 pMD18-T-SDRx重組質粒測序結果
        2.3.4 pET-15b-SDRx重組質粒鑒定
        2.3.5 pET-15b-SDRx重組質粒測序結果
    2.4 結果討論
第三章 重組SDRx脫氫酶的表達及純化
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要儀器及藥品
        3.1.2 主要試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 SDRx重組蛋白的誘導及表達
        3.2.2 SDRx重組蛋白的純化及鑒定
    3.3 結果
        3.3.1 重組載體p ET-15b-SDRx轉入表達菌種
        3.3.2 IPTG誘導工程菌表達
        3.3.3 蛋白含量檢測
    3.4 結果與討論
第四章 SDRx蛋白多克隆抗體的制備及效價測定
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要儀器及藥品
    4.2 實驗方法
        4.2.1 小鼠多克隆抗體的制備
        4.2.2 抗體效價的測定
        4.2.3 ELISA標準曲線的建立
    4.3 結果
        4.3.1 多克隆抗體效價
        4.3.2 ELISA標準曲線的建立
    4.4 結果討論
第五章 構建SDRx敲除菌株并研究其生理活性
    5.1 實驗材料
        5.1.1 主要儀器
        5.1.2 主要試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 引物的設計與合成
        5.2.2 SDRx基因同源重組片段的PCR擴增
        5.2.3 PCR產(chǎn)物的鑒定
        5.2.4 重組載體p MD18-T-SDRx300 的構建
        5.2.5 重組載體p CR2.1-TOPO-SDR300 的構建
        5.2.6 SDRx降解激素的功能表征
        5.2.7 LB培養(yǎng)基中甾體激素殘留量的HPLC分析
    5.3 結果
        5.3.1 目的基因的獲取
        5.3.2 pCR2.1-TOPO-MSDRx重組質粒的構建
        5.3.3 睪丸酮叢毛單胞菌SDRx敲除株PCR驗證
        5.3.4 HPLC檢測甾體激素殘留量結果
    5.4 結果討論
第六章 三種蛋白對SDRx脫氫酶調控作用的研究
    6.1 實驗材料
    6.2 實驗內容
        6.2.1 目的基因的克隆
        6.2.2 pMD18-T-107SDRx/LysR/TetR重組質粒的構建
        6.2.3 pK18-107SDRx,pUC19-LysR/TetR重組質粒的構建
        6.2.4 pK18-107SDRx分別與pUC19-LysR/LuxR/TetR質粒共轉化
        6.2.5 共轉化菌株的誘導表達及總蛋白的提取
        6.2.6 間接法ELISA檢測共轉化菌株總蛋白中SDRx脫氫酶含量
    6.3 結果
        6.3.1 目的基因的獲取
        6.3.2 pMD18-T-TetR/LysR/107SDRx重組載體的鑒定
        6.3.3 pMD18-T-TetR/LysR/107SDRx雙酶切鑒定
        6.3.4 pK18-107SDRx,pUC19-LysR/LuxR/TetR重組質粒鑒定
        6.3.5 測序結果
        6.3.6 質粒共轉化及ELISA方法鑒定
    6.4 結果討論
結論與展望
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]LuxR家族調控蛋白的結構及功能[J]. 鄭世超,羅瑛,魯濤.  生命科學. 2010(09)
[2]甾體雌激素的污染狀況與去除途徑[J]. 任海燕,紀樹蘭,崔成武,劉志鵬,王道,陳莎.  中國給水排水. 2004(12)
[3]甾體激素對人卵巢癌細胞系3AO增殖分化的影響[J]. 徐明娟,崔英,王昭梅,宋亮年.  上海醫(yī)學. 2001(02)

博士論文
[1]睪丸酮叢毛單胞菌7α-羥基類固醇脫氫酶的表達及調控分析[D]. 冀偉.吉林大學 2013
[2]睪丸酮叢毛單胞菌teiR基因功能及表達調控研究[D]. 陳建秋.福建農(nóng)林大學 2009

碩士論文
[1]睪丸酮叢毛單胞菌TetR對甾體類化合物水解酶3,17β-HSD和3α-HSD表達的調節(jié)[D]. 陳羚.長春理工大學 2017
[2]睪丸酮叢毛單胞菌LysR基因對3,17β-羥基類固醇脫氫酶的調控分析[D]. 李艷紅.長春理工大學 2015
[3]睪丸酮叢毛單胞菌LysR基因的克隆、表達及對3α-HSD/CR的調控研究[D]. 于航.長春理工大學 2009



本文編號：3201555