長(zhǎng)野芽孢桿菌（Bacillus naganoensis）來源的普魯蘭酶（GenBankNo.JN872757.1）在高溫、酸性環(huán)境條件下有較好的耐受性,滿足淀粉工業(yè)中糖化過程的要求,可以提高淀粉質(zhì)原料的利用率,提高工業(yè)生產(chǎn)的效率。枯草芽孢桿菌是食品級(jí)生產(chǎn)菌株,具有完善的蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯和分泌系統(tǒng)。因此,本研究通過同源重組,將長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶基因整合在枯草芽孢桿菌基因組中進(jìn)行表達(dá),構(gòu)建了分別包含組成型啟動(dòng)子PHpaⅡ和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PsacB的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng),并對(duì)酶活較高的重組菌進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化,主要內(nèi)容如下:（1）從以往構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pMA0911-PHpaⅡ-pul中獲得普魯蘭酶基因表達(dá)框PHpⅡ-pul,構(gòu)建了枯草芽孢桿菌整合載體pDL-PHpaⅡ-pul,并將普魯蘭酶基因分別整合在B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的基因組中實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá),經(jīng)過72 h發(fā)酵,重組菌B.subtilis WB800-PHpaⅡ-pul（以下簡(jiǎn)稱8H）和B.subtilis WB600-PHpa Ⅱ-pul（以下簡(jiǎn)稱6H）的胞外酶活分別為30.32U·mL-1和18.83U... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：44 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 普魯蘭酶概述
    1.2 普魯蘭酶的研究進(jìn)展
        1.2.1 普魯蘭酶的產(chǎn)酶微生物及其酶學(xué)性質(zhì)
        1.2.2 普魯蘭酶異源表達(dá)的研究進(jìn)展
    1.3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)
        1.3.1 概述
        1.3.2 枯草芽孢桿菌宿主菌株
        1.3.3 枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子
    1.4 枯草芽孢桿菌整合載體
        1.4.1 枯草芽孢桿菌整合載體的整合機(jī)理
        1.4.2 枯草芽孢桿菌整合載體的整合方式
    1.5 本課題的立題意義與研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 供試菌株,質(zhì)粒與引物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 培養(yǎng)基與溶液
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        2.2.3 重組菌株的篩選與鑒定
        2.2.4 重組菌株生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵曲線的測(cè)定
        2.2.5 誘導(dǎo)型重組菌株的表達(dá)與誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        2.2.6 普魯蘭酶表達(dá)的SDS-PAGE分析
        2.2.7 普魯蘭酶酶活的測(cè)定
第三章 結(jié)果與討論
HpaⅡ-pul和pDL-P_sacB-pul的構(gòu)建">    3.1 整合質(zhì)粒pDL-P_HpaⅡ-pul和pDL-P_sacB-pul的構(gòu)建
        3.1.1 普魯蘭酶基因表達(dá)框的擴(kuò)增
HpaⅡ-pul的構(gòu)建">        3.1.2 整合質(zhì)粒pDL-P_HpaⅡ-pul的構(gòu)建
sacB-pul的構(gòu)建">        3.1.3 整合質(zhì)粒pDL-P_sacB-pul的構(gòu)建
    3.2 枯草芽孢桿菌整合菌株的篩選與鑒定
        3.2.1 氯霉素篩選枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化菌株濃度的確定
        3.2.2 枯草芽孢桿菌整合菌株基因組的鑒定
    3.3 組成型重組菌株的表達(dá)與發(fā)酵優(yōu)化
        3.3.1 重組菌普魯蘭酶的表達(dá)分析
        3.3.2 重組菌8H發(fā)酵條件的優(yōu)化
        3.3.3 最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵過程曲線
    3.4 誘導(dǎo)型重組菌株的表達(dá)與誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        3.4.1 蔗糖誘導(dǎo)型重組菌株的表達(dá)
        3.4.2 蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.4.3 最佳誘導(dǎo)條件下的發(fā)酵過程曲線
主要結(jié)論與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄:作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]凹凸棒土對(duì)陽(yáng)離子淀粉的吸附性能及其在紙漿中的應(yīng)用[J]. 高慶春,程金蘭,杜書蘭,張皓羽.  林業(yè)工程學(xué)報(bào). 2019(02)
[2]淀粉種類與結(jié)構(gòu)對(duì)其上漿性能的影響[J]. 范雪榮,潘鵬.  棉紡織技術(shù). 2018(11)
[3]枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)及其啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J]. 余小霞,田健,劉曉青,伍寧豐.  生物技術(shù)通報(bào). 2015(02)
[4]一個(gè)新型耐熱普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 甄杰,胡政,李樹芳,徐健勇,宋詼.  生物工程學(xué)報(bào). 2014(01)
[5]長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 張艷,路福平,劉逸寒,李玉,張春峰.  生物技術(shù)通報(bào). 2012(07)
[6]小麥淀粉流變學(xué)特性分析[J]. 袁超,劉亞偉.  糧食與油脂. 2005(02)

碩士論文
[1]普魯蘭酶基因在重組枯草芽孢桿菌中的表達(dá)調(diào)控元件優(yōu)化[D]. 鄧怡.江南大學(xué) 2018
[2]高強(qiáng)度凝膠堵水工藝實(shí)驗(yàn)研究[D]. 蘇鑫.東北石油大學(xué) 2017
[3]長(zhǎng)野芽胞桿菌（Bacillus naganoensis）普魯蘭酶的高效表達(dá)與分泌調(diào)控[D]. 嚴(yán)偉.江南大學(xué) 2013
[4]雙親性淀粉衍生物的制備及其應(yīng)用[D]. 宋師偉.北京化工大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3153338