目的:通過原核表達系統(tǒng)表達人Nek2蛋白,優(yōu)化表達條件并純化Nek2蛋白,制備抗Nek2多克隆抗體。方法:將Nek2基因片段構(gòu)建到原核表達載體pET30a（+）上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）;加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達,對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG終濃度、誘導(dǎo)時間等條件進行優(yōu)化;利用12%SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切膠純化蛋白質(zhì),將純化后的Nek2蛋白進行質(zhì)譜鑒定;純化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體,運用ELISA、Western blot和免疫熒光實驗檢測多克隆抗體效價和特異性。結(jié)果:構(gòu)建了pET30a（+）-Nek2重組原核表達質(zhì)粒,誘導(dǎo)的重組人Nek2蛋白主要以包涵體的形式存在;蛋白質(zhì)的最適誘導(dǎo)表達條件為28℃,180r/min條件下加入終濃度為0. 2mmol/L IPTG誘導(dǎo)32h;質(zhì)譜分析純化后的蛋白質(zhì)為Nek2蛋白,最終獲得濃度為1. 35mg/ml純化后的Nek2蛋白;純化蛋白免疫小鼠,多克隆抗體效價大于1∶243 000,且具有良好的抗原特異性;免疫熒光實驗顯示Nek2主要定位于細胞質(zhì)和細胞核。結(jié)論:利用重組人Nek2蛋白獲得具... 

【文章來源】：中國生物工程雜志. 2020,40(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

p ET30a(+)-Nek2載體構(gòu)建

12%SDS-PAGE結(jié)果顯示，隨著溫度升高，蛋白質(zhì)表達量增加，28℃時蛋白質(zhì)表達量最高(P<0.05)，溫度進一步上升，蛋白質(zhì)表達量開始下降(圖2b、圖3a)，說明重組人Nek2蛋白最適誘導(dǎo)溫度為28℃。不同濃度的IPTG對蛋白質(zhì)進行誘導(dǎo)，與0.4mmol/L和0.6mmol/L組相比，0.2mmol/L組蛋白質(zhì)表達量相對較高(P<0.05)，而與0.8mmol/L和1.0mmol/L組相比沒有差異(P>0.05)(圖2c、圖3b)，因此確定IPTG的最適誘導(dǎo)終濃度為0.2mmol/L。隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組人Nek2蛋白的表達量逐漸遞增，32h時蛋白質(zhì)表達量最高(P<0.05)，超過32h蛋白質(zhì)表達量開始下降(圖2d、圖3c)，說明蛋白質(zhì)最適誘導(dǎo)時間為32h。圖3 不同條件下電泳條帶的灰度值

不同條件下電泳條帶的灰度值

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3131917