目的:雄性生殖細(xì)胞從具有有絲分裂活性的原始生殖細(xì)胞發(fā)育為成熟精子的過程被稱為精子發(fā)生。精子發(fā)生起源于精原干細(xì)胞,分為精原細(xì)胞的有絲分裂期、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂期和精子形成期三個(gè)階段。精原細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂后在精子形成期發(fā)生一系列復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重塑最終形成成熟精子。許多與精子形成期相關(guān)的基因在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的早期如精原細(xì)胞中已經(jīng)開始轉(zhuǎn)錄,此時(shí)轉(zhuǎn)錄的m RNA在細(xì)胞發(fā)育至后期時(shí)才被翻譯為蛋白質(zhì)并發(fā)揮功能。精卵發(fā)生特異表達(dá)螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1（Spermatogenesis-and oogenesis-specific b HLH transcription factor-1,Sohlh1）在雄性生殖細(xì)胞中主要表達(dá)于A1-A4型精原細(xì)胞,編碼蛋白含有一個(gè)b HLH結(jié)構(gòu)域,可以形成異二聚體或同型二聚體與DNA上的E-box序列CANNTG結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Sohlh1基因敲除雄性小鼠不育,精原細(xì)胞發(fā)育及分化異常導(dǎo)致進(jìn)入減數(shù)分裂的精母細(xì)胞減少,無成熟精子產(chǎn)生�；蛐酒瑱z測結(jié)果顯示出生后7天野生型雄鼠與Sohlh1基因敲除雄鼠睪丸組織中Sox30、Rnf17等精子發(fā)生中關(guān)鍵... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文截短片段 DNA 序列，見圖 3。綜合分析 Sox30 啟動(dòng)子序列、pMD18-T Vector 和 pGL3.0-Basic Vector 上的共用酶切位點(diǎn)，選取啟動(dòng)子上游引物 5′端的 KpnⅠ酶切位點(diǎn)和位于下游引物 3′端的 HindIII 酶切位點(diǎn)，利用雙酶切法獲得啟動(dòng)子序列，并將目的序列連接到pMD18-T Vector 和 pGL3.0-Basic Vector 上，載體信息見圖 4。

圖 4. pMD18-T Vector 結(jié)構(gòu)示意圖及 pGL3.0-BasicVector 結(jié)構(gòu)示意圖 Sox30 啟動(dòng)子全長和啟動(dòng)子截短序列的 pMD18-T-Sox30 質(zhì)x30 基因啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增及純化 DNA 為 PCR 反 應(yīng) 的 擴(kuò) 增 模 板 ， 使 用 NEB Q5DN-Fidelity DNA Polymerase）擴(kuò)增 Sox30 基因的啟動(dòng)子全長及截短片應(yīng)體系：劑 使用量 8High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μlQ5Amplification Buffer 10.0 μlQ5High GC Enhancer 10.0 μlTP（2.5 μM) 4.0 μlrward primer（10 μM） 2.5 μlverse primer（10 μM） 2.5 μl


本文編號：3096607