傳染病是一類由各種病原體引起的具有傳染性和流行性的疾病。病毒和細菌是引起多數(shù)傳染病的主要病原體�；赥aq Man探針的實時熒光定量PCR（q PCR）常用于病毒和細菌的診斷或定量。具有高變異特性的病毒（尤其是RNA病毒）限制q PCR擴增的檢測能力和效率。此外,隨著細菌對臨床常用抗生素的耐藥性日益增加,多重耐藥細菌不斷增多,傳統(tǒng)q PCR難以實現(xiàn)單管對多個耐藥基因同時檢測�；谏鲜鰡栴},本研究分別建立了兩種q PCR檢測方法,主要研究內(nèi)容如下:（1）RSV耐錯配型q PCR檢測方法的構(gòu)建呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是導(dǎo)致嬰幼兒急性呼吸道感染的主要病毒病原體之一。RSV感染的及時診斷,對治療和預(yù)防RSV感染很重要。本部分基于高保真DNA聚合酶的3’-5’外切酶特性,建立了一種新型耐錯配的q PCR,并應(yīng)用于RSV的檢測,與傳統(tǒng)q PCR相比,該法對突變體的擴增效率更高并具有良好的靈敏度和特異性,檢測限可達1.8 PFU/m L。該法對80%RSV陽性樣品檢測的Ct值相對較低,通過對這些樣本進行測序分析發(fā)現(xiàn),樣本與引物3’端有錯配,證明... 

【文章來源】：上海大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

qPCR染料法原理

上海大學(xué)碩士學(xué)位論文9圖1.2TaqMan探針原理Figure1.2PrincipleofTaqManprobe②TaqMan探針（MGB）TaqMan-MGB探針是將水解探針的淬滅集團替換成了非熒光淬滅基團，從而大大降低本底信號的強度[61]。同時探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高5°C-10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan水解探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。③分子信標分子信標是一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，和TaqMan探針一樣，其兩端也有熒光基團和淬滅基團修飾（圖1.3）[62]。體系中無模板時，探針發(fā)夾結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定，釋放出的熒光信號非常微弱；體系中存在模板時，探針部分序列和模板特異結(jié)合，破壞發(fā)卡結(jié)構(gòu)使修飾的基團分離，因而儀器可以接收到強烈的熒光信號[63]。分子信標廣泛運用于病原體檢測和單核苷酸多態(tài)性檢測[64,65]等方面。

上海大學(xué)碩士學(xué)位論文10圖1.3分子信標原理Figure1.3PrinciplesofMolecularBeacons④其它熒光探針雙雜交探針（如圖1.4A）是兩個特異性探針，一個只5’端標記熒光基團，另一個只3’端標記猝滅基團。這兩個探針序列和模板特異性結(jié)合，結(jié)合的位置非常鄰近[66]。在qPCR反應(yīng)的退火階段，當(dāng)兩個探針與模板結(jié)合時，位于兩個探針頭尾的熒光基團之間產(chǎn)生FRET現(xiàn)象，促進受體的熒光基團釋放一種波長的熒光信號，從而達到實時監(jiān)控反應(yīng)進程的目的。Amplifluor系統(tǒng)[67]（如圖1.4B）包括兩個特異性引物和一條通用引物（UniPrimer），其中一條引物的5’末端帶有部分序列和UniPrimer的3’末端部分序列相同。UniPrimer兩端分別被熒光和淬滅基團標記且有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。反應(yīng)時，UniPrimer結(jié)合到特異性引物擴增出的模板上作為引物進行PCR反應(yīng)，在延伸的過程中UniPrimer發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，熒光信號釋放。蝎形引物[68]（如圖1.4C）為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其5’端帶有一個熒光基團FAM，3’端帶有一個淬滅基團DABCYL，其環(huán)的部分序列和模板完全互補配對。體系有模板時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，熒光和淬滅基團相距近，不能檢出熒光信號；體系無模板時，蝎形引物和模板特異性結(jié)合并起始PCR擴增，蝎形引物的環(huán)結(jié)構(gòu)與擴增出的模板互補雜交，導(dǎo)致莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出大量的熒光信號，熒光儀器可以實時收集這些熒光信號并生成相應(yīng)的熒光擴增曲線。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌耐藥耐受性機制的最新研究進展[J]. 李昕,曾潔,王岱,薛云新,趙西林.  中國抗生素雜志. 2020(02)
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[3]抗生素的細菌耐藥性及應(yīng)對措施[J]. 任祥友,蔣瑞芹,崔玉芹.  中國民康醫(yī)學(xué). 2010(13)



本文編號：3072846