生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展對(duì)光學(xué)顯微成像的性能,如空間分辨率、成像速度、多維度信息、成像質(zhì)量等提出了更高的要求。光片熒光顯微采用一個(gè)薄片光從側(cè)面激發(fā)樣品,在正交方向探測(cè)成像,具有快速三維層析成像和對(duì)樣品光漂白和光毒性小的優(yōu)點(diǎn),是活體生物樣品長(zhǎng)時(shí)間顯微觀測(cè)的理想工具。本文介紹了光片熒光顯微成像技術(shù)的基本原理及其主要特點(diǎn);綜述了光片熒光顯微面臨的主要技術(shù)問(wèn)題,以及為解決這些問(wèn)題而發(fā)展出的新原理、新思路和新方法;例舉了光片熒光顯微成像技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用;討論了該技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)及前景。該研究旨在幫助研究者系統(tǒng)了解光片熒光顯微成像技術(shù)的基本知識(shí)、最新研究發(fā)展趨勢(shì)和潛在應(yīng)用,為該領(lǐng)域科學(xué)研究提供參考。 

【文章來(lái)源】：激光與光電子學(xué)進(jìn)展. 2020,57(10)北大核心

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【部分圖文】：

圖1 兩種顯微成像方式對(duì)比。（a）光片熒光顯微從側(cè)面用薄光片照明，只激發(fā)探測(cè)物鏡焦平面處的樣品發(fā)射熒光，在正交方向上收集熒光信號(hào)成像；（b）落射式熒光顯微用同一物鏡激發(fā)和收集熒光，光路經(jīng)過(guò)的在焦和離焦樣品都會(huì)被激發(fā)

圖1 兩種顯微成像方式對(duì)比。（a）光片熒光顯微從側(cè)面用薄光片照明，只激發(fā)探測(cè)物鏡焦平面處的樣品發(fā)射熒光，在正交方向上收集熒光信號(hào)成像；（b）落射式熒光顯微用同一物鏡激發(fā)和收集熒光，光路經(jīng)過(guò)的在焦和離焦樣品都會(huì)被激發(fā)3 光片熒光顯微的主要技術(shù)問(wèn)題

研究人員通過(guò)掃描具有無(wú)衍射特性的貝塞爾光束、艾里光束等生成如圖3(b）和（c）所示的新型光片場(chǎng)，以解決光片熒光顯微系統(tǒng)觀測(cè)視場(chǎng)與軸向分辨率相互制約的問(wèn)題。Planchon等[15]通過(guò)一維掃描傳播過(guò)程中能維持光束形貌不變的零階貝塞爾光束生成強(qiáng)度均勻的貝塞爾光片，然而貝塞爾光束的同心環(huán)狀旁瓣產(chǎn)生的離焦背景噪聲，既降低了成像對(duì)比度和系統(tǒng)軸向分辨率，又增大了光漂白和光毒性效應(yīng)。Fahrbach等[42]結(jié)合共聚焦技術(shù)解決了貝塞爾光片熒光顯微成像對(duì)比度和軸向分辨率低的問(wèn)題，然而該方法合成一幅高對(duì)比度的二維圖像需要拍攝上百幅低對(duì)比度的圖像，系統(tǒng)的成像速度降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。Olarte等[43]利用雙光子激發(fā)熒光有效抑制了貝塞爾光束旁瓣產(chǎn)生的離焦背景噪聲，并保證了系統(tǒng)的成像速度，但高強(qiáng)度超短飛秒光脈沖的光漂白性強(qiáng)且難以進(jìn)行多色熒光成像。Vettenburg等[44]將艾里光片應(yīng)用到光片熒光顯微中，在保證軸向分辨率前提下將視場(chǎng)擴(kuò)大了10倍（視場(chǎng)173μm×173μm，軸向分辨率0.86μm），但是艾里光片照明得到的熒光圖像必須進(jìn)行去卷積處理才能真實(shí)還原出樣品信息。本課題組也開(kāi)展了基于無(wú)衍射光束的光片熒光顯微研究，提出了互補(bǔ)光束相減光片熒光顯微成像技術(shù)（CBS-LSFM)[29]，它的原理如圖4所示。該方法的核心是設(shè)計(jì)并實(shí)驗(yàn)生成貝塞爾光束的互補(bǔ)光束，該互補(bǔ)光束也具有無(wú)衍射特性，可滿足大視場(chǎng)成像需求；掃描該光束生成的互補(bǔ)光片中心光強(qiáng)為零，其他位置處強(qiáng)度分布和貝塞爾光片旁瓣強(qiáng)度分布一致[45]。分別用貝塞爾光片和互補(bǔ)光片照明樣品拍攝兩幅熒光圖像，然后將二者相減，可消除貝塞爾光束旁瓣對(duì)成像的影響，從而實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)高軸向分辨率成像（視場(chǎng)300μm×210μm，軸向分辨率1μm，橫向分辨率0.45μm）�；パa(bǔ)光片相減法用于光片熒光顯微同時(shí)引起其他科研人員的關(guān)注和研究[38,46]。為解決實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)噪聲影響成像質(zhì)量的問(wèn)題，我們提出了一種基于壓縮感知盲解卷和去噪圖像處理方法[30]。該方法可同時(shí)對(duì)熒光圖像進(jìn)行解卷和去噪處理，可有效抑制偽影，將信噪比提高2倍，顯著提高圖像對(duì)比度和質(zhì)量。互補(bǔ)光束相減法需要拍攝兩幅熒光圖像才能計(jì)算出一幅高分辨、高質(zhì)量的圖像，成像速度受到一定限制且會(huì)額外增加光劑量。為了解決該問(wèn)題，利用深度學(xué)習(xí)進(jìn)行圖像處理，可以直接從傳統(tǒng)的貝塞爾光片拍攝的圖像計(jì)算出與互補(bǔ)光片相減法一致的高質(zhì)量圖片，有效提高了成像速度并降低曝光劑量[31]。

【參考文獻(xiàn)】：
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