簡便的RNA剪切加工位點(diǎn)鑒定方法對于細(xì)菌核糖核酸內(nèi)切酶功能和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機(jī)制的研究至關(guān)重要。本研究基于第二代測序技術(shù),開發(fā)了一種能夠精確鑒定RNA剪切加工位點(diǎn)及其剪切效率的高通量測序方法。在該方法中,首先將各種潛在RNA剪切加工的DNA片段分別克隆至報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,然后利用其下游特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,直接構(gòu)建約500 bp的雙端測序cDNA文庫,并在Illumina MiSeq平臺(tái)對該文庫進(jìn)行測序。最后通過對reads 5′末端的比對定位,精確測定發(fā)生RNA剪切的位點(diǎn)。利用該方法,成功鑒定了來自Ruminiclostridium Cellulolyticum的cip-cel mRNA中的3個(gè)RNA剪切加工位點(diǎn)。與傳統(tǒng)引物延伸和5′RACE等方法相比,該方法不僅具有更高的安全性和通量,同時(shí)還可像Northern印跡鑒定RNA的剪切效率。 

【文章來源】：中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2020,36(06)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 Materials and Methods
    1.1 Strains and culture conditions
    1.2 Plasmid construction and transformation
    1.3 RNA extraction
    1.4 Northern blot hybridization
    1.5 Construction of the cDNA library
    1.6 Sequencing data analysis
2 Results
    2.1 Construction of recombinant plasmids
    2.2 Analysis of RNA processing of the cip-cel operon
    2.3 Construction of cDNA library for high-throughput sequencing
    2.4 Determination of RNA processing sites
3 Discussion



本文編號(hào)：3063151