布魯氏菌引起的布魯氏菌病是一種自然疫源性傳染病,可引起多種動(dòng)物和人感染,危害極其嚴(yán)重。布魯氏菌的致病性主要表現(xiàn)為炎性因子造成的炎癥損傷,其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）,然而T4SS的功能是由分泌蛋白介導(dǎo)的。前期研究證明BMEI0340蛋白是T4SS的分泌蛋白,通過比對(duì)分析發(fā)現(xiàn):該蛋白與多種細(xì)菌中調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)的脂蛋白Pal同源,因此推斷該蛋白可能與調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)有關(guān)。另外有大量研究表明:脂蛋白Pal具有良好的免疫原性。本研究通過實(shí)驗(yàn)確定分泌蛋白BMEI0340是否參與調(diào)控炎性因子表達(dá),進(jìn)而鑒定其關(guān)鍵功能區(qū),并對(duì)該蛋白免疫原性進(jìn)行研究。本研究從以下兩方面進(jìn)行開展,結(jié)果如下:1.確定分泌蛋白BMEI0340是否參與調(diào)控炎性因子表達(dá)并鑒定其關(guān)鍵功能區(qū)利用BMEI0340蛋白編碼基因序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增BMEI0340基因,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)�；D(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。經(jīng)WB驗(yàn)證表達(dá)后,將BMEI0340蛋白純化,獲得高純度蛋白刺激鼠源巨噬細(xì)胞,測定炎性因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:BMEI0340蛋白可以上調(diào)與布魯氏菌病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)。為確定上... 

【文章來源】：河北科技師范學(xué)院河北省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

BMEI0340序列分析

第二章確定分泌蛋白BMEI0340對(duì)炎性因子的調(diào)節(jié)進(jìn)而鑒定其關(guān)鍵功能區(qū)292.3分泌蛋白BMEI0340截短表達(dá)為確定該蛋白影響細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵功能區(qū)，將BMEI0340蛋白進(jìn)行截短表達(dá)，截短表達(dá)方案如下。圖2-1BMEI0340蛋白截短表達(dá)方案Fig.2-1truncatedexpressionofBMEI0340protein根據(jù)截短方案的要求，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，向賽百勝公司提交訂單合成引物。將尾部截短40個(gè)氨基酸后表達(dá)的蛋白命名為24蛋白，頭部截短46個(gè)氨基酸后表達(dá)的蛋白命名為70蛋白。用于擴(kuò)增24蛋白、70蛋白編碼的基因引物見表2-6。表2-624、70蛋白引物信息Table2-624,70Proteinprimerinformation將24蛋白、70蛋白編碼的基因構(gòu)建到克隆載體pET32上，然后通過PCR、雙酶切驗(yàn)證其成功表達(dá)后，分別提取24蛋白、70蛋白陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TransB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，經(jīng)SDS-PAGE引物名稱引物序列酶切位點(diǎn)擴(kuò)增片段長24-FATGGATCCGGCTGTGCGTCAAAGAAGAACBamHI318bp24-RAAAAGCTTCGGCACACCGCGCGAAGCGAGGAAGTHindIII70-FAAGGATCCATCCGCGCCGATGCGCAGCAGACGCTBamHI300bp70-RAAAAGCTTTTACCGTCCGGCCCCGTTGAHindIII

第二章確定分泌蛋白BMEI0340對(duì)炎性因子的調(diào)節(jié)進(jìn)而鑒定其關(guān)鍵功能區(qū)30和Westernblot分析24蛋白、70蛋白是否成功表達(dá)。確認(rèn)表達(dá)后大量誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解菌體，分離上清、沉淀SDS-PAGE電泳確定其表達(dá)形式，并利用合適的純化方式對(duì)蛋白進(jìn)行純化，除去干擾物質(zhì)和細(xì)菌，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定24、70蛋白的濃度，分裝于PCR小管中放于-20℃?zhèn)溆茫瑢?4蛋白、70蛋白梯度稀釋，同時(shí)設(shè)置陰性、陽性對(duì)照作用細(xì)胞，測定其炎性因子表達(dá)水平，通過分析數(shù)據(jù)確定其影響細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)段，具體操作同2.2.1-2.2.5。2.4結(jié)果2.4.1分泌蛋白BMEI0340編碼基因的擴(kuò)增以滅活的布魯氏菌核酸為模板,利用表2-1中引物0340-F,0340-R成功擴(kuò)增出該蛋白的編碼基因，與預(yù)期大小一致，條帶單一，擴(kuò)增良好，如圖2-2。圖2-2PCR擴(kuò)增分泌蛋白BMEI0340編碼基因Fig.2-2PCRamplificationofsecretoryproteinBMEI0340codinggeneM:D2000plusDNALadder;1:BMEI0340基因2.4.2pET32a-BMEI0340表達(dá)載體的構(gòu)建將擴(kuò)增后的分泌蛋白BMEI0340pcr產(chǎn)物膠回收，使用限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII，將BMEI0340片段與pET32a表達(dá)載體同時(shí)酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，重組載體鑒定引物PCR鑒定陽性菌株，將鑒定為陽性的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，使用BamHI、HindIII限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]IL-1β、TNF-α聯(lián)合IL-6對(duì)胃癌的診斷價(jià)值[J]. 董志強(qiáng),劉美榮,任秀梅.  實(shí)用癌癥雜志. 2020(01)
[2]布魯氏菌病合并脊柱炎和關(guān)節(jié)炎的疼痛分值與血清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-2的變化特點(diǎn)[J]. 龐盼,張?zhí)?關(guān)建萍,張峰波,扈會(huì)整,彭巧君.  中國免疫學(xué)雜志. 2019(15)
[3]布魯氏菌病的流行特征及動(dòng)物疫苗的研究進(jìn)展[J]. 馮學(xué)明,冉多良.  中獸醫(yī)學(xué)雜志. 2019(05)
[4]布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0742基因的原核表達(dá)及功能分析[J]. 豆曉霞,劉洋,李敏,荊明龍,李明奇,王小鳳,陳創(chuàng)夫,張輝.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(12)
[5]布魯氏菌病的研究進(jìn)展[J]. 張海霞,孫曉梅,魏凱,劉娜,王玉建,徐煜琳,朱琳.  山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2018(03)
[6]牛種布魯氏菌病疫苗的研究進(jìn)展[J]. 高玉環(huán),王慧軍,趙魯,李正道.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2017(08)
[7]布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白基因VceA的原核表達(dá)、純化及功能分析[J]. 史靜雪,劉來珍,李敏,荊明龍,劉洋,張?jiān)?劉航,張輝.  石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2017(01)
[8]布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白BMEI1135基因缺失株的構(gòu)建及鑒定[J]. 江雅麗,王震,陳創(chuàng)夫,李爽,李志強(qiáng),張輝,郭飛.  石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2016(05)
[9]布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0339基因的原核表達(dá)及免疫反應(yīng)性分析[J]. 劉來珍,孫志華,劉娟,史靜雪,陳創(chuàng)夫,張輝.  石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2015(06)
[10]布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白BspB的原核表達(dá)及布魯氏菌免疫逃逸分析[J]. 李默,易德武,王遠(yuǎn)志,陳創(chuàng)夫,于潞,張俊波,郭飛.  中國病原生物學(xué)雜志. 2015(09)

博士論文
[1]布魯氏菌外膜蛋白Omp25對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D]. 羅小毛.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018
[2]布魯氏菌分泌蛋白的篩選及功能鑒定[D]. 吳同壘.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3052534