乙酰輔酶A被廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)研究中,使用TPP代替昂貴的ATP為輔因子合成乙酰輔酶A受到廣泛關(guān)注。新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）來(lái)源的丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶（Tn PFOR）在大腸桿菌中進(jìn)行了重組表達(dá),分析了其酶學(xué)特性,并探討了利用嗜熱酶（TnPFOR）酶法合成乙酰輔酶A。采用pET-20b（+）載體,將新阿波羅棲熱袍菌來(lái)源的四亞基組成的嗜熱酶（Tn PFOR）在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá);通過(guò)熱處理和陰離子交換層析法純化嗜熱酶（TnPFOR）;重組表達(dá)的嗜熱酶（TnPFOR）的最適反應(yīng)溫度和pH分別為90℃和6. 5,TnPFOR在90℃下孵育1h時(shí)保留了50%活性。利用嗜熱酶（Tn PFOR）,以TPP為輔酶合成了乙酰輔酶A,并探討了不同溫度、丙酮酸鈉底物濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酰輔酶A合成的影響。得到的優(yōu)化條件為:最適反應(yīng)溫度為90℃,丙酮酸鈉濃度為1. 5mmol/L,反應(yīng)時(shí)間為2min。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物工程雜志. 2020,40(03)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

Tn PFOR酶四個(gè)亞基共表達(dá)示意圖

探討了不同溫度、pH和氧氣對(duì)重組丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶的影響。如圖4所示，重組表達(dá)的TnPFOR酶的最適反應(yīng)溫度為90℃，最適反應(yīng)p H為6.5。PFOR酶在90℃下孵育1h后，仍剩余50%以上的酶活，有很好的熱穩(wěn)定性。并且在85℃下孵育1h時(shí)保留了80%以上的活性。重組表達(dá)的TnPFOR酶對(duì)氧敏感，當(dāng)TnPFOR酶在室溫下長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中時(shí)，暴露2h后其活性逐漸下降約50%，在室溫下放置3h時(shí)，下降了60%左右的酶活性，空氣中暴露5h后，重組TnPFOR酶活性降低了近80%的活性。說(shuō)明該酶對(duì)氧氣敏感，有氧條件下容易失活(圖4d)。而來(lái)源于檸檬酸菌的PFOR酶最適反應(yīng)溫度為50℃，該酶在50℃的半衰期為33min，為了提高酶的穩(wěn)定性，需要對(duì)酶進(jìn)行固定化，固定化后的酶催化活力明顯下降。圖3 重組丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶表達(dá)和純化SDS-PAGE(a)和Native-PAGE(b)電泳圖譜

圖2 丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(a)和重組質(zhì)粒p ET-PFOR雙酶切驗(yàn)證膠圖(b)通過(guò)加入不同濃度的乙酰輔酶A(0.01～0.1mmol/L)，反應(yīng)體系中添加等量的酶，丙酮酸鈉濃度為1mmol/L，在p H 8.0和溫度90℃條件下反應(yīng)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求得重組TnPFOR酶對(duì)乙酰輔酶A的Km值為25μmol/L,Vmax為28.6U/mg。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3051038